原代细胞分离的基本方法有哪些?
人或动物体内(或胚胎)的组织，将其剪碎至1mm3的组织块，再采用如下方法进行原代细胞
分离培养：
一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的pbs清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
(一)机械分散法
1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
2、用pbs清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
(二)消化分离法
1、酶消化分离法(过夜冷消化法)
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的*，摇匀后放4℃过夜。
④次日再用hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法(edta消化法)
①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁pbs洗2-3次。
③加入消化液(*或胶原酶或edta)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入*培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
(三)原代细胞培养
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的*药物的敏感性来帮助选择有效的*方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。
(四)原代细胞的传代、保存
(1)传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。
(2)保存：dmso+培养液+血清
按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃ 过夜)→液氮。
(五)原代细胞的复苏
(1)取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。
(2)吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。
(3)用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ co2 培养箱静置培养。
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分离培养：
一、悬浮细胞的分离方法
1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的pbs清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。
3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。
4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。
二、实体组织材料的分离方法
(一)机械分散法
1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。
2、用pbs清洗两次后
①用吸管吹打，分散组织细胞。
②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出。
③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。
3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。
4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。
(二)消化分离法
1、酶消化分离法(过夜冷消化法)
①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。
②再用hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。
③加入0.25%的*，摇匀后放4℃过夜。
④次日再用hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。
⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。
2、非酶消化法(edta消化法)
①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。
②将碎组织块在平皿中用无钙镁pbs洗2-3次。
③加入消化液(*或胶原酶或edta)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。
④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入*培养基。
⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
(三)原代细胞培养
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的*药物的敏感性来帮助选择有效的*方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。
(四)原代细胞的传代、保存
(1)传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。
(2)保存：dmso+培养液+血清
按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃ 过夜)→液氮。
(五)原代细胞的复苏
(1)取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。
(2)吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。
(3)用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ co2 培养箱静置培养。
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