高效液相色谱串联质谱法同时检测大豆不同部位的4种植物激素
摘 要：采用双三元液相色谱(dual gradient liquid chromatography,dglc)建立了在线固相萃取技术与电喷雾 串联质谱联用方法(online spe dglc鄄esi ms / ms),并成功应用于实际样品检测。 本方法同时检测大豆不同 部位中的 4 种酸碱性植物激素(赤霉素(ga3)、吲哚乙酸(iaa)、玉米素(zt)和脱落酸(aba))。 通过考察固 相萃取富集柱、分析色谱柱、流动相对植物激素的保留和选择性的影响,获得较高的灵敏度、回收率、稳定性及精 密度。 大豆样品经液氮低温研磨,以 80% 甲醇溶液提取,再经离心稀释过滤后,进样分析。 进样后样品经在线 固相萃取 hypersep retain ax 柱洗脱保留,目标分析物依次转移至分析柱 acclaim pa2 色谱柱,并以 0. 1% 甲酸 和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱,采用选择反应监测离子模式(srm)同时采集正负离子通道进行定性分 析,基质标准曲线外标法进行定量分析,ga3, iaa, zt 在 0. 1 ~ 50 滋g / l 范围内线性良好,检出限为 0. 0002 滋g / g; aba 在 0. 5 ~ 50 滋g / l 的范围内线性良好,其检出限为0. 0010 滋g / g。 以 0. 8, 4. 0 和 40 滋g / l 分别 为低、中、高浓度考察 4 种植物激素的回收率为 76. 1% ~ 93. 5% ,rsd 为 0. 8% ~ 6. 0% 。 结果表明,籽粒中含有 的 aba 浓度明显高于其它部位。 本研究为快速准确地分离和测定大豆不同部位内源激素提供了有效方法。
1 引 言 ：赤霉素(ga3 )、吲哚乙酸(iaa)、玉米素(zt)和脱落酸(aba)是 4 种重要的植物内源激素,广泛分 布在植物体内,对植物细胞的生长、分化、分裂、器官建成、植物的休眠萌发形态反应等都有直接或间接 的调节控制作用,参与植物生命的所有活动[1 ~ 3] 。 但是,内源激素因其在植物中的含量极低,基质干扰 多,使得农作物内源激素的测定十分困难,因此痕量激素的测定技术已成为制约植物激素学界研究的 大瓶颈之一,同时也是分析科学领域的研究热点[4] 。 目前,关于农作物中内源激素测定的文献报道多结合液相色谱技术或液相色谱鄄质谱联用技术,进 样前几乎均采用固相萃取(spe)技术去除农作物中复杂基质干扰。 显然,固相萃取技术在复杂基体中 痕量组分分析中处于核心地位,是农作物内源激素测定较为理想的选择[5,6] 。 已发表的文献报道表明, 其所采用的固相萃取方法处理过程基本上还处在手工操作阶段,存在过程复杂、耗材消耗量大、有毒试 剂接触多、需要额外氮吹、重现性差、无法实现全自动联机和通量低等问题。 本实验所采用的在线固相 萃取技术是一种全自动的在线样品前处理方式,是近年来商品化的仪器样品前处理新技术。 在线联接 可避免因复杂前处理过程而带来的分析物损失,减少操作者因溶剂挥发与有毒溶剂的接触,节省时间, 提高效率、可靠性和灵敏度,在线固相萃取分析越来越受到人们的重视[7,8] 。 目前,在线固相萃取技术 在农业科学领域的应用并不多见,因此本方法较已发表的关于测定植物激素的方法[9,10] 具有前处理简 便、实验快速、灵敏度高等优点。 植物激素包括生长素(auxins)、赤霉素(gibberellins)、细胞分裂素 (cytokinins)、脱落酸(abscisic acids) 和乙烯(ethylene) 五类,已发表的文献主要是考察其中某些酸 性[11]或者碱性[12]的植物激素,缺乏全面性,本研究考察的 4 种植物激素 iaa, zt, aba 和 ga3,分别属 于生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素。 本方法有利于全面考察农作物中植物激素含量。
2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 双三元液相色谱系统 ( 美国赛默飞世尔科技有限公司),配备 srd3600 六通道真空脱气机, dgp3600 rs 双梯度快速分析型色谱泵(两个*一致,同时又相互独立的三元泵,通过 chromeleon 软 件一体化控制),wps3000tsl 自动进样器,tcc鄄3000 柱温箱(配有两个六通阀),chromeleon 6. 8 变色龙 色谱管理软件。 质谱系统:tsq vantage 三重四极杆质谱系统,配有 xcalibur 数据处理系统(美国赛默飞 世尔科技有限公司),离子源:hesi。 赤霉素(ga3)、吲哚乙酸( iaa)、玉米素( zt) 和脱落酸(aba) 标准品(美国 sigma鄄aldrich 有限公 司); 乙腈、甲醇 (optima 级,美国 fisher 公司),去离子水(18. 2 m赘 cm,thermo 纯水机制备)。 植株样 品采自于黑龙江八一农垦大学作物实验基地(黑龙江省大庆市林甸县),检测样品采用液氮冷冻后,用 超低温冰箱保存。 2. 2 样品处理 大豆检测样品(叶片、荚皮、籽粒)冷冻贮存于-80 益冰箱中。 取 1 g 样品,于液氮中研磨成粉末,转 入 6 ml 预 冷 的 80% 甲 醇 ( 含 1 mmol / l bht ), 于 4 益 下 避 光 浸 提 12 h, 于 4 益 下, 以 4000 r/ min 离心 15 min, 分离上清液,沉淀物中加 2 ml 预冷的 80% 甲醇,再于 4 益下浸提 2 h,离心,合 并上清液,定容至 10 ml,用去离子水 1颐 1 稀释,过 0. 22 滋m 滤膜后,待测。 2. 3 在线固相萃取和色谱分离条件 spe column:thermo hypersep retain ax 柱(20 mm伊3. 0 mm, 3 滋m), 左泵(online spe pump),流 动相:甲醇(a)鄄水(b)。 分析柱:thermo acclaim pa2 色谱柱(150 mm伊2. 1 mm, 3 滋m),右泵 (analyti鄄 cal pump),流动相:甲醇(a)鄄0. 1% fa(b);柱温:35 益 ,进样量:10 滋l,六通阀切换程序及梯度淋洗条 件见表 1,online spe 流路见图 1。
auto tune 模式: 将 1 mg / l 标准液通过蠕动泵连续进样。 由 tsq tune 质谱参数优化软件自动获得 的子离子碰撞能量及透镜电压等,相应离子对与文献[11,12]相同,如图 2 所示。 选择反应监测(srm):针对二级质谱或多级质谱的某两级之间,即母离子选一个离子,碰撞后,从 形成的子离子中也只选一个离子。 因为两次都只选单离子,所以噪音和干扰被排除得更多,灵敏度和信 噪比会更高,尤其对于复杂的、基质背景高的样品(见图)。 质谱条件:吲哚乙酸(iaa)、玉米素(zt)采用正离子扫描方式、赤霉素(ga3 )和脱落酸(aba)采用 负离子扫描方式,同时正负切换。 雾化温度:350 益 ,鞘气 30 arb,辅助气:10 arb,collision gas pressure:1. 5 mtorr,离子传输管温度 270 益 ,质谱扫描参数: 扫描方式: srm, 扫描循环时间: 0. 8 s, 分辨率: q1, q3 分辨率均设置为 0. 4 fwhm。 具体的加热电喷雾电离(hesi) 模式扫描条件件见表 2。
3 结果与讨论 3. 1 spe 柱的选择 spe 的分离保留机理有反相、正相、离子交换、体积排阻、免疫亲和等,ga3 、aba、iaa 的 pka分别为 第 12 期 贾鹏禹等: 在线固相萃取鄄高效液相色谱鄄串联质谱法同时检测大豆不同部位的 4 种植物激素 1745 4. 2,4. 5,4. 7,为酸性化合物; zt 的 pka = 11. 4,为碱性化合物。 现有的 spe 方法多数只同时分析酸 性[11]或者碱性的植物激素[12] ,这样只能得到片面的结果。 或者采用两次不同的 spe (max、mcx)方 式分别纯化酸性或碱性植物激素,后合并净化后的样品[13] ,其涉及的前处理过程十分复杂,影响重现 性等。 本方法对 spe 柱类型、上样流速、ph 值、有机试剂等影响在线分析的主要因素进行了分析。 选择 turboflow mcx,turboflow max,ag19,retain cx,retain ax 进行比较。 其中,turboflow 系列 柱需要运用体积排阻、离子交换、反相保留的机理,上样速度一般要求 2 ml / min,以形成涡流,但在对 4 种植物激素的保留过程中, 始终无法同时保留,尤其是 ga3 在 turboflow 柱上始终在死时间直接被洗 脱下来。 ag19 是一种运用在离子色谱上的阴离子交换保护柱,对酸性化合物有较好的保留性能,但对 上样溶剂的 ph 值有一定的要求,只能用中性流动相上样,否则难以保留,这就与 mcx 的上样条件相冲 突。 考虑到通过在 retain ax 是一种高纯度,高渗透的苯乙烯二乙烯基聚合物,通过键合季氨基增加对 酸性化合物(ga3 , aba, iaa)的保留,同时具有一定的反相保留性能,可保留碱性化合物 zt。 流动相的选择对在线固相萃取具有显著影响,甲醇、乙腈是反相色谱中常用的有机试剂,本方法选 择流动相主要是考虑其对分析物的保留与基质的分离和在质谱中离子响应的高低。 在选定 retain ax 柱作为 spe 柱后,当用乙腈作为流动相时,碱性的 zt 在 retain ax 柱上的保留性能明显下降,在死时间 直接被洗脱下来,无法与基质分离;但选择甲醇作为上样流动相时,这种情况就可以避免,推断 zt 在 retain ax 上的保留主要是依靠反相色谱原理,与其在反相色谱中的保留性能有明显的相关性。 本方法 同时采集正负离子信号,不宜添加过多的酸碱离子添加剂。 在相同条件下,采用甲醇作为分析流动相 时,植物激素的响应值明显优于乙腈。 综合以上因素,本方法选择甲醇鄄水作为分析流动相。
4 结 论 本实验建立了双三元液相色谱串联质谱 测定大豆不同部位的内源激素在线固相萃取 液质联用分析方法。 在满足常规分析的同时, 针对本实验中遇到的基质干扰大、样品前处理 复杂、重现性差、目标分析物含量低等问题 通过 online spe 技术在线除杂富集解决,有较多成熟的应用[15,16] 。 通过与已发表的关于植物激素研究的文献比较[11,12] ,本方法的检测限有明显优势,通过选择合适 的 spe 柱,保证不同性质的植物激素可以同时保留,与基质分离,一次进样同时检测酸碱性植物激素, 第 12 期 贾鹏禹等: 在线固相萃取鄄高效液相色谱鄄串联质谱法同时检测大豆不同部位的 4 种植物激素 1747 检测结果更加全面,提高了检测效率。 文献[17]采用 hplc 方法分析大豆中的植物激素, ga3 检出限 为 0. 5 滋g / g,样品未检出,aba 含量明显高于其它成分。 本实验结果与文献[17]相符。 本方法样品前 处理简单方便,灵敏度高,固相萃取在线分析技术是一种高通量,快速的植物内源激素检测技术,检出限 完*满足农业科学研究需要。 被测组分提取、浓缩、分离的在线进行,不仅省时而且改善了检出限;而 且具有抗化学干扰、可靠性好的优点,特别适用于复杂基质中低含量组分的检出。 本方法将有望广泛地 应用于农业科学领域生理生化指标中被测物的高灵敏度、高准确度检测。
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1 引 言 ：赤霉素(ga3 )、吲哚乙酸(iaa)、玉米素(zt)和脱落酸(aba)是 4 种重要的植物内源激素,广泛分 布在植物体内,对植物细胞的生长、分化、分裂、器官建成、植物的休眠萌发形态反应等都有直接或间接 的调节控制作用,参与植物生命的所有活动[1 ~ 3] 。 但是,内源激素因其在植物中的含量极低,基质干扰 多,使得农作物内源激素的测定十分困难,因此痕量激素的测定技术已成为制约植物激素学界研究的 大瓶颈之一,同时也是分析科学领域的研究热点[4] 。 目前,关于农作物中内源激素测定的文献报道多结合液相色谱技术或液相色谱鄄质谱联用技术,进 样前几乎均采用固相萃取(spe)技术去除农作物中复杂基质干扰。 显然,固相萃取技术在复杂基体中 痕量组分分析中处于核心地位,是农作物内源激素测定较为理想的选择[5,6] 。 已发表的文献报道表明, 其所采用的固相萃取方法处理过程基本上还处在手工操作阶段,存在过程复杂、耗材消耗量大、有毒试 剂接触多、需要额外氮吹、重现性差、无法实现全自动联机和通量低等问题。 本实验所采用的在线固相 萃取技术是一种全自动的在线样品前处理方式,是近年来商品化的仪器样品前处理新技术。 在线联接 可避免因复杂前处理过程而带来的分析物损失,减少操作者因溶剂挥发与有毒溶剂的接触,节省时间, 提高效率、可靠性和灵敏度,在线固相萃取分析越来越受到人们的重视[7,8] 。 目前,在线固相萃取技术 在农业科学领域的应用并不多见,因此本方法较已发表的关于测定植物激素的方法[9,10] 具有前处理简 便、实验快速、灵敏度高等优点。 植物激素包括生长素(auxins)、赤霉素(gibberellins)、细胞分裂素 (cytokinins)、脱落酸(abscisic acids) 和乙烯(ethylene) 五类,已发表的文献主要是考察其中某些酸 性[11]或者碱性[12]的植物激素,缺乏全面性,本研究考察的 4 种植物激素 iaa, zt, aba 和 ga3,分别属 于生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素。 本方法有利于全面考察农作物中植物激素含量。
2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 双三元液相色谱系统 ( 美国赛默飞世尔科技有限公司),配备 srd3600 六通道真空脱气机, dgp3600 rs 双梯度快速分析型色谱泵(两个*一致,同时又相互独立的三元泵,通过 chromeleon 软 件一体化控制),wps3000tsl 自动进样器,tcc鄄3000 柱温箱(配有两个六通阀),chromeleon 6. 8 变色龙 色谱管理软件。 质谱系统:tsq vantage 三重四极杆质谱系统,配有 xcalibur 数据处理系统(美国赛默飞 世尔科技有限公司),离子源:hesi。 赤霉素(ga3)、吲哚乙酸( iaa)、玉米素( zt) 和脱落酸(aba) 标准品(美国 sigma鄄aldrich 有限公 司); 乙腈、甲醇 (optima 级,美国 fisher 公司),去离子水(18. 2 m赘 cm,thermo 纯水机制备)。 植株样 品采自于黑龙江八一农垦大学作物实验基地(黑龙江省大庆市林甸县),检测样品采用液氮冷冻后,用 超低温冰箱保存。 2. 2 样品处理 大豆检测样品(叶片、荚皮、籽粒)冷冻贮存于-80 益冰箱中。 取 1 g 样品,于液氮中研磨成粉末,转 入 6 ml 预 冷 的 80% 甲 醇 ( 含 1 mmol / l bht ), 于 4 益 下 避 光 浸 提 12 h, 于 4 益 下, 以 4000 r/ min 离心 15 min, 分离上清液,沉淀物中加 2 ml 预冷的 80% 甲醇,再于 4 益下浸提 2 h,离心,合 并上清液,定容至 10 ml,用去离子水 1颐 1 稀释,过 0. 22 滋m 滤膜后,待测。 2. 3 在线固相萃取和色谱分离条件 spe column:thermo hypersep retain ax 柱(20 mm伊3. 0 mm, 3 滋m), 左泵(online spe pump),流 动相:甲醇(a)鄄水(b)。 分析柱:thermo acclaim pa2 色谱柱(150 mm伊2. 1 mm, 3 滋m),右泵 (analyti鄄 cal pump),流动相:甲醇(a)鄄0. 1% fa(b);柱温:35 益 ,进样量:10 滋l,六通阀切换程序及梯度淋洗条 件见表 1,online spe 流路见图 1。
auto tune 模式: 将 1 mg / l 标准液通过蠕动泵连续进样。 由 tsq tune 质谱参数优化软件自动获得 的子离子碰撞能量及透镜电压等,相应离子对与文献[11,12]相同,如图 2 所示。 选择反应监测(srm):针对二级质谱或多级质谱的某两级之间,即母离子选一个离子,碰撞后,从 形成的子离子中也只选一个离子。 因为两次都只选单离子,所以噪音和干扰被排除得更多,灵敏度和信 噪比会更高,尤其对于复杂的、基质背景高的样品(见图)。 质谱条件:吲哚乙酸(iaa)、玉米素(zt)采用正离子扫描方式、赤霉素(ga3 )和脱落酸(aba)采用 负离子扫描方式,同时正负切换。 雾化温度:350 益 ,鞘气 30 arb,辅助气:10 arb,collision gas pressure:1. 5 mtorr,离子传输管温度 270 益 ,质谱扫描参数: 扫描方式: srm, 扫描循环时间: 0. 8 s, 分辨率: q1, q3 分辨率均设置为 0. 4 fwhm。 具体的加热电喷雾电离(hesi) 模式扫描条件件见表 2。
3 结果与讨论 3. 1 spe 柱的选择 spe 的分离保留机理有反相、正相、离子交换、体积排阻、免疫亲和等,ga3 、aba、iaa 的 pka分别为 第 12 期 贾鹏禹等: 在线固相萃取鄄高效液相色谱鄄串联质谱法同时检测大豆不同部位的 4 种植物激素 1745 4. 2,4. 5,4. 7,为酸性化合物; zt 的 pka = 11. 4,为碱性化合物。 现有的 spe 方法多数只同时分析酸 性[11]或者碱性的植物激素[12] ,这样只能得到片面的结果。 或者采用两次不同的 spe (max、mcx)方 式分别纯化酸性或碱性植物激素,后合并净化后的样品[13] ,其涉及的前处理过程十分复杂,影响重现 性等。 本方法对 spe 柱类型、上样流速、ph 值、有机试剂等影响在线分析的主要因素进行了分析。 选择 turboflow mcx,turboflow max,ag19,retain cx,retain ax 进行比较。 其中,turboflow 系列 柱需要运用体积排阻、离子交换、反相保留的机理,上样速度一般要求 2 ml / min,以形成涡流,但在对 4 种植物激素的保留过程中, 始终无法同时保留,尤其是 ga3 在 turboflow 柱上始终在死时间直接被洗 脱下来。 ag19 是一种运用在离子色谱上的阴离子交换保护柱,对酸性化合物有较好的保留性能,但对 上样溶剂的 ph 值有一定的要求,只能用中性流动相上样,否则难以保留,这就与 mcx 的上样条件相冲 突。 考虑到通过在 retain ax 是一种高纯度,高渗透的苯乙烯二乙烯基聚合物,通过键合季氨基增加对 酸性化合物(ga3 , aba, iaa)的保留,同时具有一定的反相保留性能,可保留碱性化合物 zt。 流动相的选择对在线固相萃取具有显著影响,甲醇、乙腈是反相色谱中常用的有机试剂,本方法选 择流动相主要是考虑其对分析物的保留与基质的分离和在质谱中离子响应的高低。 在选定 retain ax 柱作为 spe 柱后,当用乙腈作为流动相时,碱性的 zt 在 retain ax 柱上的保留性能明显下降,在死时间 直接被洗脱下来,无法与基质分离;但选择甲醇作为上样流动相时,这种情况就可以避免,推断 zt 在 retain ax 上的保留主要是依靠反相色谱原理,与其在反相色谱中的保留性能有明显的相关性。 本方法 同时采集正负离子信号,不宜添加过多的酸碱离子添加剂。 在相同条件下,采用甲醇作为分析流动相 时,植物激素的响应值明显优于乙腈。 综合以上因素,本方法选择甲醇鄄水作为分析流动相。
4 结 论 本实验建立了双三元液相色谱串联质谱 测定大豆不同部位的内源激素在线固相萃取 液质联用分析方法。 在满足常规分析的同时, 针对本实验中遇到的基质干扰大、样品前处理 复杂、重现性差、目标分析物含量低等问题 通过 online spe 技术在线除杂富集解决,有较多成熟的应用[15,16] 。 通过与已发表的关于植物激素研究的文献比较[11,12] ,本方法的检测限有明显优势,通过选择合适 的 spe 柱,保证不同性质的植物激素可以同时保留,与基质分离,一次进样同时检测酸碱性植物激素, 第 12 期 贾鹏禹等: 在线固相萃取鄄高效液相色谱鄄串联质谱法同时检测大豆不同部位的 4 种植物激素 1747 检测结果更加全面,提高了检测效率。 文献[17]采用 hplc 方法分析大豆中的植物激素, ga3 检出限 为 0. 5 滋g / g,样品未检出,aba 含量明显高于其它成分。 本实验结果与文献[17]相符。 本方法样品前 处理简单方便,灵敏度高,固相萃取在线分析技术是一种高通量,快速的植物内源激素检测技术,检出限 完*满足农业科学研究需要。 被测组分提取、浓缩、分离的在线进行,不仅省时而且改善了检出限;而 且具有抗化学干扰、可靠性好的优点,特别适用于复杂基质中低含量组分的检出。 本方法将有望广泛地 应用于农业科学领域生理生化指标中被测物的高灵敏度、高准确度检测。
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