明胶酶谱试剂盒的正确使用！

明胶酶谱试剂盒的正确使用！
产品描述：
基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,mmp)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，友称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的mmp-2、mmp-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。
本试剂盒采用酶谱法(zymography)检测mmp-2、mmp-9活性。zymography是一种广为使用的、基于sds-page电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1nm，高于elisa方法2，其基本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的sds-page凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应buffer孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示mmp-2、mmp-9的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供mmp-2、mmp-9特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5µl血液中的mmp-2、mmp-9酶谱及活性，检测灵敏度~1nm。试剂盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。
产品组成：
1.2 × sds-page non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 ºc；
2.10 × substrate g, 50 ml, 20 ºc；
3. 10 × buffer a, 50 ml, 4 ºc, 使用时用蒸馏水稀释；
4. 10 × buffer b, 50 ml, 4 ºc, 使用时用蒸馏水稀释；
5. sds-page 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 ºc。
实验步骤（仅供参考）
1. 制备含 mmp 底物蛋白的 sds-page 凝胶：推荐分离胶浓度为 8%。按照标准程序制备 sds- page 凝胶。将 10 × substrate g 融化，并 90 ºc 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入 10 × substrate g 并使之稀释 10 倍，混匀后加入过硫酸铵和 temed，等待凝胶聚合。
2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × sds-page non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% sds, 100 mm tris-cl ph6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染 marker即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × sds-page non-
reducing buffer 等体积混合，取 5-15µl 上样。
3. 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20ma/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4. 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内.可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10ml
1× buffer a(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。
5. 孵育：倒掉 buffer a。加入 10 ml 1× buffer b(蒸馏水稀释)，室温或 37ºc 孵育 1~5 小时。阳性对照或者血中的 mmp 通常 37ºc 孵育 1 小时即可显示。如 mmp 活性低，应延长孵育时间为 10 小时或过一夜。
6. 显色：倒掉 buffer b，加入 sds-page 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见 sds-page 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有 mmp 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 mmp-2、mmp-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在 66~72 (mmp-2)、92 (mmp-9)、130 (prommp-9)、225 (prommp-9) kda 位置出现透明条带。
7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 mmp 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色.mmp条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。
本产品仅供科研实验用，不做其它用途！