点击化学的应用——测定细胞增殖和 DNA 复制
细胞增殖测定广泛应用于细胞毒性研究、癌症研究和细胞生物学的许多其他领域。其中许多可以通过荧光标记对增殖细胞进行可视化，并且适合高通量筛选。
检测复制的 dna 可以说是检测增殖的最直接方法。这是通过使用溴脱氧尿苷 (brdu)核苷实现的，该核苷在复制过程中融入 dna。然后，细胞 dna 中的这些核苷修饰可以通过抗 brdu 抗体检测到。尽管具有特异性，但这种测定方法繁琐且难以重现，因为需要用刺激性试剂处理细胞，以使 dna 暴露于抗体，否则这些抗体不会穿透细胞结构。
一种更温和的替代方案是乙炔基脱氧尿苷 (edu)，可以通过将其添加到培养基中或注射到动物体内来将其递送至细胞。掺入 dna 后，该核苷可在铜 (i) 催化下与各种荧光染料叠氮化物结合，从而对复制的 dna 进行荧光染色。该测定易于执行、快速且可重复。它不需要对细胞进行严酷的处理（只需要用 triton 进行透化），因此可以更好地保存细胞结构。在用叠氮化染料处理和最后的洗涤步骤（步骤 8）后，可以使用具有各种发射波长的荧光团（例如 hoechst、dapi 或荧光标记抗体）来标记细胞。
所需试剂5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (edu)
cu-tbta 络合物— сlick сhemistry 催化剂
抗坏血酸— 铜的还原剂
叠氮化物荧光染料
dmso，标签级— 叠氮化物溶剂
triton x-100（或 tween-20）
pbs，ph 7.4
100 mm tris 缓冲液，ph 7.4
确切的方案取决于特定的细胞或组织类型，但一般工作流程如下所述：
将细胞/组织与 10–20 μm edu 孵育所需的时间。
用含 3.7% 甲醛的 pbs 固定细胞 15 分钟。
用 pbs 清洗细胞。
用含有 0.2% triton x-100（或 0.5% tween-20）的 pbs 透化细胞 30 分钟。
再次用 pbs 清洗细胞。
在 100 mm tris 缓冲液，ph 7.4（对于磺化叠氮化物）或 100 mm tris 缓冲液，ph 7.4，含有 50% dmso（对于非-磺化叠氮化物）。该混合物应新鲜制备，因为铜 (i) 在水溶液中不稳定。
将细胞与点击反应混合物一起孵育 30 分钟。
用 pbs 清洗细胞。
（可选）如果细胞必须用不同的荧光团标记，请使用标准方案继续染色。
磺化（水溶性）叠氮化物，例如磺基氰叠氮化物和 af 叠氮化物，可产生最佳效果。当使用非磺化叠氮化物（例如氰叠氮化物或 bdp 叠氮化物）时，确保反应混合物中 dmso 浓度为 50%。
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一种更温和的替代方案是乙炔基脱氧尿苷 (edu)，可以通过将其添加到培养基中或注射到动物体内来将其递送至细胞。掺入 dna 后，该核苷可在铜 (i) 催化下与各种荧光染料叠氮化物结合，从而对复制的 dna 进行荧光染色。该测定易于执行、快速且可重复。它不需要对细胞进行严酷的处理（只需要用 triton 进行透化），因此可以更好地保存细胞结构。在用叠氮化染料处理和最后的洗涤步骤（步骤 8）后，可以使用具有各种发射波长的荧光团（例如 hoechst、dapi 或荧光标记抗体）来标记细胞。
所需试剂5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 (edu)
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抗坏血酸— 铜的还原剂
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dmso，标签级— 叠氮化物溶剂
triton x-100（或 tween-20）
pbs，ph 7.4
100 mm tris 缓冲液，ph 7.4
确切的方案取决于特定的细胞或组织类型，但一般工作流程如下所述：
将细胞/组织与 10–20 μm edu 孵育所需的时间。
用含 3.7% 甲醛的 pbs 固定细胞 15 分钟。
用 pbs 清洗细胞。
用含有 0.2% triton x-100（或 0.5% tween-20）的 pbs 透化细胞 30 分钟。
再次用 pbs 清洗细胞。
在 100 mm tris 缓冲液，ph 7.4（对于磺化叠氮化物）或 100 mm tris 缓冲液，ph 7.4，含有 50% dmso（对于非-磺化叠氮化物）。该混合物应新鲜制备，因为铜 (i) 在水溶液中不稳定。
将细胞与点击反应混合物一起孵育 30 分钟。
用 pbs 清洗细胞。
（可选）如果细胞必须用不同的荧光团标记，请使用标准方案继续染色。
磺化（水溶性）叠氮化物，例如磺基氰叠氮化物和 af 叠氮化物，可产生最佳效果。当使用非磺化叠氮化物（例如氰叠氮化物或 bdp 叠氮化物）时，确保反应混合物中 dmso 浓度为 50%。
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