尼康显微镜切趾相差的结构图
活细胞中各种细胞内组分和质膜之间的光吸收差异通常可以忽略不计，当通过使用明场照明的经典技术通过显微镜观察时，它们几乎看不见。相差显微镜利用细胞成分内部以及未染色细胞与其周围水介质之间的微小折射率差异来在这些和类似的透明样本中产生对比度。
图1-相差光路
光穿过一个环孔或环形，安装在台下聚光前焦面，用来照亮在常规相差显微镜检体（图1）。当从相差环发出的空心光遇到透明标本时，它要么被亚细胞成分和膜衍射，要么穿过。毫无偏差地穿过样品的光以环形的形式到达物镜的后焦平面，而被样品衍射的微弱的光散布在焦平面的整个表面上。在样品衍射的光中会产生一个相对于直射光大约四分之一波长的小相移。
来自背景的直射光和来自样本的衍射光的相位差导致两个光束在中间像平面处相互干扰。这可以通过以下方式实现：通过策略性地放置在与聚光镜的环空共轭的平面（物镜后焦平面）与聚光镜的环空（聚光镜前焦距）共平面中的半透明相位板，对直射光加或减四分之一波长的偏移来实现。飞机）。直接的背景光被施加在物镜中的相位环上的中性密度薄膜所衰减。在中间图像平面上，产生干涉图案，该干涉图案产生与样本引起的相移成比例的强度。
交互式教程- 切趾相板增强样品对比度使用传统的和切趾相差显微镜检查各种标本。
相差显微镜中的不幸伪像是光环效应，会导致相对象周围出现虚假的亮区或图像中的反衬。这种效应在引起大相移的样品中尤为普遍。减少光晕伪影曾经被认为是一个困难的理论问题，但是客观相差环构型的进展导致了一种称为切趾相差的新技术（图2），该技术可以查看具有大相差的相对象的结构。并以出色的清晰度和细节清晰度进行拍照。
图2-阳极氧化相板配置
在图2中显示的是常规的（或经典的）变迹相板，它与观察者成一定角度放置，并通过中心剖开以便于说明。左侧的经典相位板位于物镜的后焦平面上，在表面上涂有一薄层中性密度材料（称为相膜）（也如图1所示）。）。胶片的目的是将穿过样本的直射光的相位延迟四分之一波长，以允许在中间像面上对衍射光产生相长干涉和相消干涉。图2的右侧是变迹相板的示意图。在该板上围绕相膜的是两个半透明的中性密度材料的同心区域，它们减小了从样品以小角度衍射的光的强度。在切趾相差显微镜中，该相位板取代了物镜后孔左侧的板。
对于两个样本，切趾相板对在显微镜中观察到的图像的影响如图3所示。图3（a）是用尼康eclipse e600显微镜以标准相差模式操作拍摄的海星胚胎的显微照片。使用的物镜是长工作距离（lwd）ph1 dl（暗光）设计为在浅灰色背景上产生深色图像轮廓。这种类型的物镜是用于细胞和其他生物材料的常规相差检类型，因为它在折射率差异较大的物体中产生的暗对比度。注意围绕在胚胎外围的光环，以及在细胞团*部分缺乏对比度和图像细节。如图3（b）所示，通过使用具有变迹相板的相应物镜，观察到对比度的显着改善。在此图中，海星胚胎的周边光晕大大降低，并且边缘更清晰，内部标本细节和视场深度也得到增强。
图3-切趾相差中的光晕减少
图3（c）和3（d）显示了一对相似的显微照片，使用了活的裸藻样品。euglenas是原生动物纲euglenida的成员，euglenida是一组非凡的单细胞生物，其中许多具有植物和动物的特征。图3（c）展示了使用dl相物镜拍摄的裸藻样本的经典相差图像。内部标本的细节形成了模糊的对比，而外部细胞膜被大量的光环围绕着。当使用变迹相位光学器件对同一样本成像时（图3（d）），光晕尺寸减小，内部样本特征得到更高度的分辨。
切趾相差理论当用平均波长集中在光谱的可见光区域（550纳米）中的光照射时，大多数相位对象（尤其是活细胞）的折射率（n）在1.36和1.37之间。对于具有球形几何形状的标本，随着标本厚度的增大，标本与周围介质之间的相位差会增大，从而导致被标本偏离的光的衍射角更小。假设是球形试样，则大相位差（δ）和直径（d）通过以下公式关联：
δ = (2π/λ)(n' - n)d
其中λ是真空（或空气）中的光的波长，n'是样品的折射率，n是周围介质（通常是缓冲水溶液）的折射率。从方程式中可以明显看出，如果样品和介质的折射率保持恒定，那么增加样品直径（d）将在照明波前违背相应较大的相位差（δ）。
现在，我们将考虑由直径为d的圆形孔径产生的衍射图样。在理想情况下，当物镜没有像差并提供均匀的圆形光圈时，当两个艾里斑的中心相距距离r（艾里斑的中心半径）时，两个相邻点就可以分辨出来。数量r由以下公式确定：
r = 0.61λ/n(sin(θ))
式中，λ为以空气为浸入介质的光的波长，θ为衍射角（孔径角）。在此讨论中，我们假设孔径d 等于分辨率距离r，然后可以得出：
r = d = 0.61λ/n(sin(θ))
重新排列为：
sin(θ) = 0.61λ/nd
将方程式（1）代入方程式（4）可得出：
sin(θ) = (2π/λ)(n' - n)0.61λ/nδ
sin(θ) = 2π(n' - n)0.61/nδ
如果衍射角（θ）小，则项sin（θ）与相位差（δ）之间存在反比关系：
sin(θ) ∝ 1/δ
为了检查中间像面上的衍射光强度和不减弱光强度，我们必须首先考虑照明波前的物理方面。如果照明波前是均匀的平面波，则入射波前（φ（0））和穿过相位物体（标本；φ（1））后的波前可以用以下公式描述：
φ(0) = sin(ωt)
φ(1) = sin(ωt + δ)
其中ω是照明波阵面的角频率，t是时间，而δ是穿过样本或周围介质的波阵面之间的相对相位差。在大多数情况下，δ的值很小，因此公式（9）简化为：
φ(1) = sin(ωt) + δcos(ωt)
等式（10）中的项描述了入射光波（等式（8）），并表示通过和围绕样品的未衍射或直射光，而第二项则表示被样品衍射的光的总和。在大多数情况下，衍射光相对于直射光具有四分之一波的相位差，并且其振幅与样品引起的相位差成正比。考虑到通过在物镜后焦平面处利用适当的纬向相移板，从光的直接部分添加（或减去）四分之一波长，公式（10）简化为：
φ(1) = (1 + δ) cos(ωt)
为了获得中间像面上的波的强度（i），我们可以采用等式（11）的平方并进行积分以消除时间依赖性：
i = (1 + δ)2
因为平方余弦的积分是常数，所以图像强度与（1 +δ）2成正比。因此，已经建立了衍射角，被样品衍射的光的振幅和相位差之间的关系。从等式（12），很明显，中间像平面上的光强度与直射光和衍射光的振幅之和成正比。应当注意，衍射光强度随场位置而变化，而直射光在整个像平面上是均匀的。
切趾相板实际上，通过利用位于后焦平面处物镜中的相板中与相膜相邻的选择性振幅滤波器，可以减少光晕并提高样品对比度。这些幅度滤波器由应用于相膜周围的相板上的中性密度滤波器薄膜组成，如图2所示。。经典相板中相移环的透射率约为25％，而切趾板中相移环周围的一对相邻环的中性密度为50％。两块板中相膜的宽度相同。这些值与相差显微镜中应用于标准板的相移薄膜的透射率值一致。
图4-阳极氧化相板中的衍射角
周围的中性密度膜的必要宽度可以通过等式（2）至（7）中讨论的衍射角（θ）来计算。该值在某种程度上取决于标本，但是尼康公司提供的商业切趾相物镜是在假定物体（标本）直径约为10微米（组织培养实验中使用的生物细胞的典型值）的情况下制造的。
切趾相差技术的基本原理如图4所示，该图说明了大小样本的效果。不同大小的样本中相位差之间的关系会严重影响切趾相板的衰减效果。较大的样本（直径大于或等于10微米）衍射的大部分光线；图4（a））穿过中性密度吸收环，将被衰减，从而降低强度。另一方面，对于直径小于10微米的样品，例如核仁，质膜和细胞质颗粒，由于大的衍射角，衍射光将通过中性密度滤光片环的外围。在这种情况下，衍射光的振幅将不会被相板的透明部分衰减，从而使标本细节呈现出高对比度（但具有相关的光晕）。
切趾技术已成功用于其他光学配置，以减小光阑处的直射光强度。在任何衍射受限的成像系统中，点扩散函数通常都具有明显强度的旁瓣或旁环。这些假象在旨在解决与强点光源相邻放置的弱点光源的系统中可能引起极大关注。术语变迹是来自希腊字，意思是“删除脚”的。用光学术语来说，“脚”被认为是衍射受限成像系统中的旁瓣或侧环。术语窗口化是*的一种通常用于数字成像的类似技术。
交互式教程- 切趾相差探索样本大小如何影响穿过变迹相板的衍射光线的角度。
一般而言，光学系统的变迹需要对通过出射光瞳的光引入振幅衰减（或在某些情况下为增强）。衰减量通常在瞳孔中心可忽略不计，但随半径增加而增大，在光圈附近的瞳孔边缘处大。换句话说，通过引入光衰减掩模可以使孔上图像的边缘“变软”。因为在突然的孔径处衍射会导致边缘波起源于边缘，所以软化效果有助于将衍射波的表观起源扩展到更宽的区域。这导致抑制了由边缘波引起的振铃效应。
为了抑制点扩散函数周围的旁瓣的强度，传统上已经采用了切趾技术来在通过光学系统的出射光瞳的光的边缘附近提供一定的透射率。然而，近年来，切趾技术已被应用于其他系统，并且被用来描述向出射光瞳引入的任何吸收，而不管旁瓣是否被抑制或加重。
总之，变迹相差光学器件的使用可显着改善图像，从而减少了光晕，并在微小的样品细节上具有高对比度。在大多数情况下，亚细胞特征（例如核仁）可以清楚地区分为具有变趾物镜的暗对比度，但是这些相同的特征具有明亮的光晕或使用常规相差光学器件成像为亮点。对于切趾光学器件，由于衍射光的振幅相对于穿过样品的直射光的振幅大，因此对比度发生了反转。
来自相位对象的图像的对比度可以通过调节围绕中心相位膜的环形中性密度区域的透射率和大小来改变。如果以透射率的梯度产生这些区域，则可以针对各种样本尺寸更紧密地控制对象对比度。
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光穿过一个环孔或环形，安装在台下聚光前焦面，用来照亮在常规相差显微镜检体（图1）。当从相差环发出的空心光遇到透明标本时，它要么被亚细胞成分和膜衍射，要么穿过。毫无偏差地穿过样品的光以环形的形式到达物镜的后焦平面，而被样品衍射的微弱的光散布在焦平面的整个表面上。在样品衍射的光中会产生一个相对于直射光大约四分之一波长的小相移。
来自背景的直射光和来自样本的衍射光的相位差导致两个光束在中间像平面处相互干扰。这可以通过以下方式实现：通过策略性地放置在与聚光镜的环空共轭的平面（物镜后焦平面）与聚光镜的环空（聚光镜前焦距）共平面中的半透明相位板，对直射光加或减四分之一波长的偏移来实现。飞机）。直接的背景光被施加在物镜中的相位环上的中性密度薄膜所衰减。在中间图像平面上，产生干涉图案，该干涉图案产生与样本引起的相移成比例的强度。
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相差显微镜中的不幸伪像是光环效应，会导致相对象周围出现虚假的亮区或图像中的反衬。这种效应在引起大相移的样品中尤为普遍。减少光晕伪影曾经被认为是一个困难的理论问题，但是客观相差环构型的进展导致了一种称为切趾相差的新技术（图2），该技术可以查看具有大相差的相对象的结构。并以出色的清晰度和细节清晰度进行拍照。
图2-阳极氧化相板配置
在图2中显示的是常规的（或经典的）变迹相板，它与观察者成一定角度放置，并通过中心剖开以便于说明。左侧的经典相位板位于物镜的后焦平面上，在表面上涂有一薄层中性密度材料（称为相膜）（也如图1所示）。）。胶片的目的是将穿过样本的直射光的相位延迟四分之一波长，以允许在中间像面上对衍射光产生相长干涉和相消干涉。图2的右侧是变迹相板的示意图。在该板上围绕相膜的是两个半透明的中性密度材料的同心区域，它们减小了从样品以小角度衍射的光的强度。在切趾相差显微镜中，该相位板取代了物镜后孔左侧的板。
对于两个样本，切趾相板对在显微镜中观察到的图像的影响如图3所示。图3（a）是用尼康eclipse e600显微镜以标准相差模式操作拍摄的海星胚胎的显微照片。使用的物镜是长工作距离（lwd）ph1 dl（暗光）设计为在浅灰色背景上产生深色图像轮廓。这种类型的物镜是用于细胞和其他生物材料的常规相差检类型，因为它在折射率差异较大的物体中产生的暗对比度。注意围绕在胚胎外围的光环，以及在细胞团*部分缺乏对比度和图像细节。如图3（b）所示，通过使用具有变迹相板的相应物镜，观察到对比度的显着改善。在此图中，海星胚胎的周边光晕大大降低，并且边缘更清晰，内部标本细节和视场深度也得到增强。
图3-切趾相差中的光晕减少
图3（c）和3（d）显示了一对相似的显微照片，使用了活的裸藻样品。euglenas是原生动物纲euglenida的成员，euglenida是一组非凡的单细胞生物，其中许多具有植物和动物的特征。图3（c）展示了使用dl相物镜拍摄的裸藻样本的经典相差图像。内部标本的细节形成了模糊的对比，而外部细胞膜被大量的光环围绕着。当使用变迹相位光学器件对同一样本成像时（图3（d）），光晕尺寸减小，内部样本特征得到更高度的分辨。
切趾相差理论当用平均波长集中在光谱的可见光区域（550纳米）中的光照射时，大多数相位对象（尤其是活细胞）的折射率（n）在1.36和1.37之间。对于具有球形几何形状的标本，随着标本厚度的增大，标本与周围介质之间的相位差会增大，从而导致被标本偏离的光的衍射角更小。假设是球形试样，则大相位差（δ）和直径（d）通过以下公式关联：
δ = (2π/λ)(n' - n)d
其中λ是真空（或空气）中的光的波长，n'是样品的折射率，n是周围介质（通常是缓冲水溶液）的折射率。从方程式中可以明显看出，如果样品和介质的折射率保持恒定，那么增加样品直径（d）将在照明波前违背相应较大的相位差（δ）。
现在，我们将考虑由直径为d的圆形孔径产生的衍射图样。在理想情况下，当物镜没有像差并提供均匀的圆形光圈时，当两个艾里斑的中心相距距离r（艾里斑的中心半径）时，两个相邻点就可以分辨出来。数量r由以下公式确定：
r = 0.61λ/n(sin(θ))
式中，λ为以空气为浸入介质的光的波长，θ为衍射角（孔径角）。在此讨论中，我们假设孔径d 等于分辨率距离r，然后可以得出：
r = d = 0.61λ/n(sin(θ))
重新排列为：
sin(θ) = 0.61λ/nd
将方程式（1）代入方程式（4）可得出：
sin(θ) = (2π/λ)(n' - n)0.61λ/nδ
sin(θ) = 2π(n' - n)0.61/nδ
如果衍射角（θ）小，则项sin（θ）与相位差（δ）之间存在反比关系：
sin(θ) ∝ 1/δ
为了检查中间像面上的衍射光强度和不减弱光强度，我们必须首先考虑照明波前的物理方面。如果照明波前是均匀的平面波，则入射波前（φ（0））和穿过相位物体（标本；φ（1））后的波前可以用以下公式描述：
φ(0) = sin(ωt)
φ(1) = sin(ωt + δ)
其中ω是照明波阵面的角频率，t是时间，而δ是穿过样本或周围介质的波阵面之间的相对相位差。在大多数情况下，δ的值很小，因此公式（9）简化为：
φ(1) = sin(ωt) + δcos(ωt)
等式（10）中的项描述了入射光波（等式（8）），并表示通过和围绕样品的未衍射或直射光，而第二项则表示被样品衍射的光的总和。在大多数情况下，衍射光相对于直射光具有四分之一波的相位差，并且其振幅与样品引起的相位差成正比。考虑到通过在物镜后焦平面处利用适当的纬向相移板，从光的直接部分添加（或减去）四分之一波长，公式（10）简化为：
φ(1) = (1 + δ) cos(ωt)
为了获得中间像面上的波的强度（i），我们可以采用等式（11）的平方并进行积分以消除时间依赖性：
i = (1 + δ)2
因为平方余弦的积分是常数，所以图像强度与（1 +δ）2成正比。因此，已经建立了衍射角，被样品衍射的光的振幅和相位差之间的关系。从等式（12），很明显，中间像平面上的光强度与直射光和衍射光的振幅之和成正比。应当注意，衍射光强度随场位置而变化，而直射光在整个像平面上是均匀的。
切趾相板实际上，通过利用位于后焦平面处物镜中的相板中与相膜相邻的选择性振幅滤波器，可以减少光晕并提高样品对比度。这些幅度滤波器由应用于相膜周围的相板上的中性密度滤波器薄膜组成，如图2所示。。经典相板中相移环的透射率约为25％，而切趾板中相移环周围的一对相邻环的中性密度为50％。两块板中相膜的宽度相同。这些值与相差显微镜中应用于标准板的相移薄膜的透射率值一致。
图4-阳极氧化相板中的衍射角
周围的中性密度膜的必要宽度可以通过等式（2）至（7）中讨论的衍射角（θ）来计算。该值在某种程度上取决于标本，但是尼康公司提供的商业切趾相物镜是在假定物体（标本）直径约为10微米（组织培养实验中使用的生物细胞的典型值）的情况下制造的。
切趾相差技术的基本原理如图4所示，该图说明了大小样本的效果。不同大小的样本中相位差之间的关系会严重影响切趾相板的衰减效果。较大的样本（直径大于或等于10微米）衍射的大部分光线；图4（a））穿过中性密度吸收环，将被衰减，从而降低强度。另一方面，对于直径小于10微米的样品，例如核仁，质膜和细胞质颗粒，由于大的衍射角，衍射光将通过中性密度滤光片环的外围。在这种情况下，衍射光的振幅将不会被相板的透明部分衰减，从而使标本细节呈现出高对比度（但具有相关的光晕）。
切趾技术已成功用于其他光学配置，以减小光阑处的直射光强度。在任何衍射受限的成像系统中，点扩散函数通常都具有明显强度的旁瓣或旁环。这些假象在旨在解决与强点光源相邻放置的弱点光源的系统中可能引起极大关注。术语变迹是来自希腊字，意思是“删除脚”的。用光学术语来说，“脚”被认为是衍射受限成像系统中的旁瓣或侧环。术语窗口化是*的一种通常用于数字成像的类似技术。
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一般而言，光学系统的变迹需要对通过出射光瞳的光引入振幅衰减（或在某些情况下为增强）。衰减量通常在瞳孔中心可忽略不计，但随半径增加而增大，在光圈附近的瞳孔边缘处大。换句话说，通过引入光衰减掩模可以使孔上图像的边缘“变软”。因为在突然的孔径处衍射会导致边缘波起源于边缘，所以软化效果有助于将衍射波的表观起源扩展到更宽的区域。这导致抑制了由边缘波引起的振铃效应。
为了抑制点扩散函数周围的旁瓣的强度，传统上已经采用了切趾技术来在通过光学系统的出射光瞳的光的边缘附近提供一定的透射率。然而，近年来，切趾技术已被应用于其他系统，并且被用来描述向出射光瞳引入的任何吸收，而不管旁瓣是否被抑制或加重。
总之，变迹相差光学器件的使用可显着改善图像，从而减少了光晕，并在微小的样品细节上具有高对比度。在大多数情况下，亚细胞特征（例如核仁）可以清楚地区分为具有变趾物镜的暗对比度，但是这些相同的特征具有明亮的光晕或使用常规相差光学器件成像为亮点。对于切趾光学器件，由于衍射光的振幅相对于穿过样品的直射光的振幅大，因此对比度发生了反转。
来自相位对象的图像的对比度可以通过调节围绕中心相位膜的环形中性密度区域的透射率和大小来改变。如果以透射率的梯度产生这些区域，则可以针对各种样本尺寸更紧密地控制对象对比度。
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