细胞凋亡检测及分子生物学检测步骤
细胞凋亡检测及分子生物学检测步骤：
1、细胞dna含量分布（由细胞dna降解方式检测细胞凋亡）
收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml；
离心除去固定液，3mlpbs重悬细胞;
使用低速离心机 1500rpm 离心， 5分钟，弃去pbs；
加pi染液1ml，室温避光20 分钟；
调整细胞浓度5×105/ml；
上机检测。
2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡
1) 常规 制 备 单 细胞 悬 液 , 用pbs洗 两 次.( 若为 全 血 要 先 溶血),取约5×106个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl1×bindingbuffer 重悬；
2)分成a、b、c、d、e 五管，每管约1×106个细胞
a)阴性对照，不加任何试剂；
b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定 30 分钟,加annexinv5μl,室温 10min,用1×bindingbuffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μlpi 避光15 分钟
c) 加10μl pi，避光孵育 15 分钟；
d)加5μlannexinv液，室温避光孵育15min；
e) 加10μl pi 和5μlannexinv 液，室温避光孵育5min；
3)每管各加400μl1×binding buffer。
4)上机检测。
注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；
b. 操作时注意避光；
c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。
3、用单克隆抗体apo2.7 检测细胞凋亡
1)放置0.5~1×106 个细胞到试管中；
2) 室温离心200g，6min；
3) 弃上清，加入 100μl冷的（4℃)在 pbsf溶液中含100µg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；
4)加入2ml冷的（4℃) pbsf液，室温离心200g，6min；
5) 弃上清， 加入20μl pe 标记的apo2.7 单克隆抗体和80μl pbsf液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15 分钟；
6)加入2ml pbsf液，室温离心200g，6min；
7) 弃上清，加入1ml pbsf液重悬细胞；
8)避光保存，直到流式细胞仪检测。
pbsf：含2.5%fcs（v/v）和0.01%nan3（w/v）的pbs。
更多实验室仪器设备使用方法、实验试剂、实验耗材购买可以咨询苏州阿尔法生物实验器材有限公司。
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离心除去固定液，3mlpbs重悬细胞;
使用低速离心机 1500rpm 离心， 5分钟，弃去pbs；
加pi染液1ml，室温避光20 分钟；
调整细胞浓度5×105/ml；
上机检测。
2、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡
1) 常规 制 备 单 细胞 悬 液 , 用pbs洗 两 次.( 若为 全 血 要 先 溶血),取约5×106个细胞，1500rpm离心,弃上清,用400μl1×bindingbuffer 重悬；
2)分成a、b、c、d、e 五管，每管约1×106个细胞
a)阴性对照，不加任何试剂；
b) 阳性对照,加2%多聚甲醛固定 30 分钟,加annexinv5μl,室温 10min,用1×bindingbuffer洗一次,弃上清再加190μl 缓冲液、10μlpi 避光15 分钟
c) 加10μl pi，避光孵育 15 分钟；
d)加5μlannexinv液，室温避光孵育15min；
e) 加10μl pi 和5μlannexinv 液，室温避光孵育5min；
3)每管各加400μl1×binding buffer。
4)上机检测。
注意 a. 操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；
b. 操作时注意避光；
c. 反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。
3、用单克隆抗体apo2.7 检测细胞凋亡
1)放置0.5~1×106 个细胞到试管中；
2) 室温离心200g，6min；
3) 弃上清，加入 100μl冷的（4℃)在 pbsf溶液中含100µg/ml的digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育20min；
4)加入2ml冷的（4℃) pbsf液，室温离心200g，6min；
5) 弃上清， 加入20μl pe 标记的apo2.7 单克隆抗体和80μl pbsf液，用vortex轻轻震荡，室温避光孵育15 分钟；
6)加入2ml pbsf液，室温离心200g，6min；
7) 弃上清，加入1ml pbsf液重悬细胞；
8)避光保存，直到流式细胞仪检测。
pbsf：含2.5%fcs（v/v）和0.01%nan3（w/v）的pbs。
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