遗传学检测方法:荧光原位杂交(FISH)vs 微整列比较基因组杂交(aCGH)

细胞遗传学的检测分析可以帮助我们了解染色体的变异,进而对相关疾病更深入的了解。染色体的异常可能导致基因表达的失调或产生新的突变蛋白,从而构成癌症、不孕症和各种先天性疾病(如唐氏综合征)。非整倍体、缺失、重复和重排等都属于染色体异常的类型,再比如基因组拷贝数变异(copy number variation, cnv),是遗传病和出生缺陷的重要原因之一。
核型分析(karyotyping)是一种传统的细胞遗传学研究方法,该方法可以用来识别主要的染色体异常,如单体、多体、染色体重排以及大片段缺失或重复。然而,该方法受限于低分辨率和较窄的目标范围,因此只能检测较大的染色体变化(通常为> 5 mb)。此外,它是一种主观技术,因此异常的检测通常依赖于分析人员的专业知识。
荧光原位杂交技术(fish)和微整列比较基因组杂交(acgh)可以对染色体和基因组结构做进一步的分析,接下来就为大家介绍一下两种技术和各自的应用:
荧光原位杂交技术(fish)
fish是一项分子细胞生物学技术,广泛用于检测和定位细胞中的dna序列。该技术应用特异性的荧光标记探针与染色体或核酸样本进行杂交,通过荧光显微镜实现目标dna或rna序列的可视化。
实现fish技术主要包括以下的几步骤:
1.样本制备阶段:提取细胞或组织样本,通过固定和制片的过程使样本处于适合杂交的状态。需要根据不同的样本类型选择不同的预处理方式:
●细胞或组织的固定
●脱蜡(ffpe组织)
●抗原的修复
●酶促透化作用
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货号 产品名 规格
enz-acc112-0100 antigen retrieval reagent, ph 6 (10x) 100ml
enz-acc113-0100 antigen retrieval reagent, ph 9 (10x) 100ml
enz-33801 proteinase k 2x5mg
2.杂交:将荧光标记的dna/rna探针加入到制备好的样本上,并在特定的条件下促进探针与目标序列的杂交。
2.1 nick translation自己设计rna/dna探针
rna/dna探针可以选择自己设计和合成,这项技术称为nick translation(切口平移)主要的操作流程如下:
使用nick translation dna labeling kit(enz-gen111)标记tp53 bac dna探针的orange 552 dutp (enz-42842)和着丝粒17 bac dna探针的green 496 dutp (enz-42831)。标记探针与中期扩散杂交。
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产品名 货号 规格
nick translation dna labeling system 2.0 enz-gen111 50 reactions
bio-16 dutp enz-42811 50nmol
digoxigenin dutp enz-nuc113 25nmol
seebright®aqua 431 dutp enz-42853 25nmol
seebright®green 496 dutp enz-42831 25nmol
seebright®green 500 dutp enz-42845 25nmol
seebright®gold 525 dutp enz-42843 25nmol
seebright®gold 550 dutp enz-42521 25nmol
seebright®orange 552 dutp enz-42842 25nmol
seebright®red 580 dutp enz-42844 25nmol
seebright®red 650 dutp enz-42522 25nmol
seebright®far-red 673 dutp enz-nuc116 25nmol
2.2 即用型dna/rna探针
目前市面上有提供很多ready-to-use型的rna/dna探针,可直接用于检测目标基因,省去了自己制备的步骤。比如针对hpv病毒、经典的肿瘤靶点(egfr)、gadph以及泛素化等等常用病理靶点
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货号 产品名 规格
enz-gen145-2000 ampiview™ hpv 6/11 rna probes set 2 ml
enz-gen146-2000 ampiview™ hpv 16/18 rna probes set 2 ml
enz-gen147-2000 ampiview™ hpv 31/33/51 rna probes set 2 ml
enz-32886 patho-gene®hpv type 16/18 probe 1 ml
enz-32886-6000 6 ml
enz-gen114-6000 digx® hpv type 16/18/31/33/51 probe 6 ml
enz-gen114-1000 1 ml
enz-gen125-2000 ampiview™ ubiquitin (as) dig rna probes set 2ml
enz-gen129-2000 ampiview™ egfr (as) dig rna probes set 2ml
enz-gen127-2000 ampiview™ gapdh (as) dig rna probes set 2ml
也有可以同时检测四个不同靶点的探针试剂盒,如下图所示,是在正常细胞和染色体异常的细胞中对ckdn2a、cen3、cen7、cen17这四种基因(膀胱癌常见变异基因)同时检测后的结果,可以发现cen3、cen7、cen17三种基因在不正常细胞中数量有增多
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enz-gen440-0020 deepsee®cdkn2a/cen3/7/17 quad probe assay 20tests
enz-gen440-0100 deepsee®cdkn2a/cen3/7/17 quad probe assay 100tests
3.显色:
与免疫组化类似,偶联了荧光标记之后,需要加入显色剂进行后续的检测,显色剂有操作简便的“一步法”试剂,或当样本丰度较低时或希望获得更低背景的结果时,有“两步法”试剂。“两步法”检测试剂其实就是在rna/dna探针上偶联一个anti-biotin或anti-digoxin的信号放大试剂,然后再加入对应的显色试剂。
figure. 显色试剂的两种检测方法,一步法(左)两步法(右)
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产品名 货号 规格
一步法检测试剂
saview®plus ap reagent enz-acc111-0150 150 tests
saview®plus hrp reagent enz-acc102-0150 150 tests
两步法检测试剂
mouse anti-biotin linker (ready-to-use) enz-32893-6000 6ml
rabbit anti-biotin linker (ready-to-use) enz-32892-6000 6ml
polyview®plus ap (anti-mouse) reagent enz-acc114-0150 150 tests
polyview®plus ap (anti-rabbit) reagent enz-acc110-0150 150 tests
polyview®plus hrp (anti-mouse) reagent enz-acc104-0150 150 tests
polyview®plus hrp (anti-rabbit) reagent enz-acc103-0150 150 tests
4.检测:最后通过荧光显微镜观察及摄影,分析荧光信号的分布和强度,就可以确定目标序列的存在与位置。
fish技术由于其精确性,被广泛应用于以下几个领域:
1. 染色体异常检测:用以检测染色体结构的畸变,如易位、缺失、复制及非整倍性等。
2. 基因定位与映射:确定特定基因在染色体上的精确位置。
3. 染色体结构研究:观察染色体结构变化,及在细胞周期中的动态变化。
fish技术有如下的几个优点:
1. 高分辨率:fish能够在单个细胞层面上进行检测,实现精确定位。
2. 操作灵活性:可用于多种样本类型,包括冰冻、石蜡包埋组织及活细胞。
3. 多色标记:可同时使用多种不同颜色的探针对多个目标进行检测。
当然,fish技术也存在一定的局限性:
1. 对目标序列的依赖性:需要预先知道目标dna或rna序列才能设计相应的探针。
2. 操作复杂性:过程较为繁琐,包括样本制备、探针制备和信号检测等,需要经验较丰富的操作人员。
3. 仪器要求:需使用昂贵的荧光显微镜,并对显微镜操作有一定要求。
微阵列比较基因组杂交(acgh)技术
acgh技术是检测与染色体异常相关的基因拷贝数增加和拷贝数丢失的有力工具。与其他技术(如fish和g-banding karyotyping)相比,acgh检测染色体畸变更快、更稳定、结果更优越,从而能够更好地了解染色体变化在遗传性疾病和癌症中的作用。
cgh是通过将实验样本和对照样本的dna用红绿荧光标记之后,然后与芯片进行杂交之后,借用专门的数据分析软件检测红绿荧光的比值,将两个样本间的dna拷贝数变化进行比较,最终得出实验样本的dna拷贝数是减少还是增加。该技术的具体步骤如下图所示:
figure. acgh技术实验步骤(图源来自:10.1007/s10072-016-2658-y)
步骤一:抽提样本的dna,并分别将对照样本和实验样本的dna进行黄绿荧光的标记
figure four replicate 500-ng dna samples were labeled with enzo’s cytag®cgh labeling kit(enz-42671)for oligo arrays or leading competitor’s kits. enzo’s proprietary labeling technology generates the highest specific activity of labeling.
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cytag®cgh labeling kit enz-42671-k010 2x10 reactions
enz-42671-k100 2x100 reactions
cytag®totalcgh labeling kit enz-42674-0010 2x10 reactions
enz-42674-0100 2x100 reactions
cytag®supercgh labeling kit enz-gen120-0010 2x10 reactions
enz-gen120-0100 2x100 reactions
步骤二:将标记之后的dna混合并与芯片杂交
步骤三:用荧光扫描仪读取芯片上的荧光信号
步骤四:通过相关分析软件,分析荧光信号并识别拷贝数的增加或减少
通过阵列分析软件计算荧光的log2比率(cy5/cy3),通过这种方式,可以识别dna中的缺失或重复。与对照样本相比,在染色体的特定区域中,如果实验样本颜色的强度较高,表明该区域的dna增多,而如果对照样本颜色的强度较高,表明该特定区域的dna丢失。中性色表示两个样品在此片段无差异,所以是正常状态。
在临床上,以acgh技术和snp技术向结合为基础的染色体微阵列分析技术已成功在产前诊断中有所应用
figure. 对3677名高龄产妇进行a-cgh产前诊断,染色体异常在不同高龄孕妇中的具体分布表格,来源:doi: 10.12182/20210160601
使用cgh技术可以测定整个基因组,且无需细胞培养;但不能检测平衡的染色体改变-,且该实验技术需要较高质量的dna样本
两种技术都为现代遗传学研究提供了du特的工具,尽管它们在原理和应用上有所不同,但都是评估基因组结构变化不可huo缺的方法。fish以其高精度和灵活性在定位染色体的特定区域上显得无ke替代,而cgh则在全基因组分析方面展现了强大的能力。
fish cgh
敏感性 通过使用荧光探针对特定的基因或染色体区域进行定位,因此在检测具体基因突变或特定染色体异常方面非常敏感。 cgh适用于检测dna全基因组水平的拷贝数变异(cnv)。虽然它对拷贝数改变非常敏感,但没有fish那样可以达到单个基因或小片段精度的能力。
特异性 探针设计的特异性决定了fish检测的准确度,正确设计的探针可以精确标记目标序列,从而提供高特异性的检测结果。 cgh能够比较样本整体基因组与参考基因组之间的差异,从而确定拷贝数增加或减少,但无法提供fish所提供的确切染色体定位信息。
应用类型 1. 单基因或特定染色体区域的病理研究。2. 诊断特定的染色体异常,如染色体断裂和易位。3. 遗传性疾病和癌症中染色体畸形的诊断。 1. 全基因组水平的拷贝数变异检测。2. 肿瘤基因组的全面分析,以发现肿瘤驱动基因的变异。3. 检测整个基因组的遗传异质性。
技术选择建议 若研究需要定量分析特定基因或染色体区域的变化,fish是一个更好的选择 若研究关注于全基因组水平的变化或需要筛查未知的基因变化,cgh能提供更全面的信息
表. fish技术和cgh技术的对比
关于enzo life
enzo life做为分子诊断领域的先驱者,可提供包括基因、蛋白、细胞、组织全层面的标记和检测试剂,如原位杂交探针、活细胞荧光探针、组化试剂盒、小分子化学文库等。除了科研领域外,enzo life还给提供多样的生物工艺质量检测试剂盒(如protein a残留检测盒,hcp残留检测等 )
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