流式胞内染色中常用的活化方法
流式实验应用中，除了常见的表面抗原染色，还会进行胞内因子检测，比如：常见的细胞因子：ifn、il-2、il-4、il-6、il-10、tnf；核内转录因子：foxp3、gata3、stat5；胞内信号通路相关蛋白：mapk家族 (akt、p38、jnk、erk) 等。胞内染色步骤相对复杂，涉及的变异因素多，很容易出现结果不稳定、较难重复等问题。
一般情况下，静息状态的t、b细胞不产生或极低产生细胞因子，多数细胞因子必须在t细胞激活后才能分泌产生，所以必须采用体外激活来刺激细胞因子的表达。流式胞内染色中*常用的活化方法就是使用一定浓度的广泛性刺激剂：pma (佛波酯) 和lonomycin (离子霉素)，刺激细胞4-6 h (可优化)。
pma和lonomycin刺激细胞活化的机制：在细胞内，protein kinase c(pkc) 的激活，可以引起下游众多蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致多种蛋白的表达引起细胞的活化。pkc可以在dag (二酯酰甘油) 和calcium (ca2+) 的共同作用下被激活，pma是一种dag的模拟物，lonomycin 是ca2+的转运剂，可将细胞器内的ca2+ 转运到胞浆，所以pma和lonomycin的共同作用可以激活pkc，从而引起一系列的下游反应。
刺激后的细胞不能直接进行流式检测，细胞因子会分泌到胞外影响实验结果，还需要加入阻断剂，将细胞因子阻断在胞内，有助于细胞因子的聚集使胞内染色信号增强，提高检出率，所以这一步至关重要。常用的阻断剂有两种：1. monensin (莫能霉素)；2. brefeldin a (bfa，布雷非德菌素a)。
monensin是一种离子载体(ionophore)，可选择性结合单价阳离子如：li+、na+、k+、rb+、ag+和tl+，并把这些阳离子转运到细胞膜内，破坏跨膜离子梯度；bfa是一种真菌代谢物，可以干扰囊泡自粗面内质网至高尔基体的转运。这两种阻断剂的区别：monensin的阻断作用在高尔基体转运到胞外，bfa的阻断作用在内质网转运到高尔基体。
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