苯并[c]噻吩荧光团的抗猝灭NIR-II J聚集体实现高效生物成像和光疗诊断
本文要点：具有第二近红外（nir-ii）发射的分子荧光团由于其优异的生物相容性和高分辨率，在深层组织生物成像方面具有巨大的潜力。最近，j-聚集被用于构建长波长nir-ii发射器，因为它们的光带在形成水分散性纳米聚集体时显示出显著的红移。然而，由于j型主链的种类有限和严重的荧光猝灭，它们在nir-ii荧光成像中的广泛应用受到了阻碍。在此，我们报道了一种具有抗猝灭效应的明亮的苯并[c]噻吩（bt）j聚集荧光团（bt6），用于高效的nir-ii生物成像和光疗诊断。bt荧光团被操纵以具有超过400nm的斯托克斯位移和聚集诱导发射（aie）特性，以克服j型荧光团的自猝灭问题。在水性环境中形成bt6组件后，800nm以上的吸收和1000nm以上的nir-ii发射分别提高了41倍和26倍以上。全身血管的体内可视化和图像引导的光疗结果证明bt6 np是nir-ii荧光成像和癌症光热疗法的优秀试剂。本研究开发了一种策略，以构建具有精确操纵的抗菌性能的明亮nir-ii j聚集体，用于高效生物医学应用。
1.简介：
在过去的十年里，第二近红外窗口（nir-ii，900-1700 nm）中的荧光生物成像由于其高分辨率、低组织自发荧光以及深组织穿透性，在生物医学领域具有很大的前景。目前，许多nir-ii荧光材料，如量子点、碳纳米管、稀土掺杂纳米颗粒（np）和有机小分子已经成功构建。其中，共轭小分子由于其优越的生物相容性和强的近红外（nir）吸收，在体内医学诊断和光疗方面表现出非凡的优势。然而，它们的实际应用往往因荧光亮度不令人满意而受到阻碍。
与单体状态相比，j聚集体显示出红移的吸收和发射带，这可用于开发高效的nir-ii发射体。然而，大多数报道的荧光团在形成纳米颗粒后显示出h型或无序聚集，由于其刚性和平面分子结构，近红外吸收和荧光性能减弱。只有少数类型的荧光团具有j型填充特性，如二吡咯甲ji硼（bodipy）、花青、方胺和苝双酰亚胺。最近，基于传统的j型分子骨架开发了几种nir-ii发射j聚集体。它们的吸收和发射带红移到更长的波长区域，这有利于体内生物成像。尽管如此，j-聚集体在nir-ii荧光成像中的广泛应用受到j-型主链种类有限的阻碍。此外，由于难以避免的自猝灭效应，先前报道的nir-ii j聚集体的荧光产率对于实现有效的生物成像是不令人满意的。因此，强烈需要开发用于nir-ii荧光成像的具有明亮荧光的新型j型发射材料。
自猝灭效应是影响近红外荧光团成像性能的主要问题之一。例如，花青和方酸染料的斯托克斯位移通常低于100nm，这导致它们发射的光子的不可避免地被自吸收。此外，由于聚集引起的猝灭（acq）效应，许多报道的具有疏水性特征的nir-ii小分子在形成水分散性纳米颗粒时往往显示出严重降低的亮度。因此，开发具有抗猝灭能力的nir-ii荧光团对于实现高质量的体内生物成像具有重要意义。据我们所知，由于缺乏合适的分子主干和实现抗猝灭能力的问题，此类j聚集体尚未报道。
作为概念验证，我们首先制备了苯并[c]噻吩（bt）基衍生物bt3，这在我们之前的研究中有报道。[47]由于强烈的电子推拉效应，它表现出强烈的di yi近红外（nir-i，700-900nm）吸收和nir-ii发射，斯托克斯位移为156nm。在水中形成纳米聚集体后，bt3 np在吸收和发射方面表现出有趣的红移，说明了j聚集特性。然而，bt3单体的明亮荧光由于acq效应而被严重猝灭。然后，我们在苯并[c]-噻吩和bt3的二聚胺之间引入二甲基亚苯基，以产生具有较大结构畸变的bt6分子。由于延长的供体和增加的供体-受体（d-a）构象扭曲，分子内电荷转移（ict）效应大大改善，这将bt6的斯托克斯位移延长到326 nm（方案1）。在形成水分散性np后，bt6 np显示出优选的j型聚集，其提供红移吸收，并且808nm处的吸光度从其分离的分子增加了41倍。此外，由于聚集诱导发射（aie）效应，nir-ii荧光增强了26倍，峰值从953 nm红移到1054 nm。因此，我们的分子设计策略可以同时实现两个目标：增加的斯托克斯位移和aie效应，这可以有效地解决荧光团的自猝灭问题。同时，bt6np在808nm激光照射下可产生大量活性氧（ros）和放热来用于癌症光疗。所开发的bt6 np成功应用于全身血管的nir-ii荧光成像和成像引导的小鼠肿瘤光疗。总之，本研究通过调节stokes位移和聚集体的发射行为，构建了一个明亮的苯并噻吩j聚集体，用于体内nir-ii生物成像和癌症热分析，同时为合理设计具有抗猝灭性能的荧光团提供了范例。更重要的是，bt6分子是用一种新型的d-a配置的主链构建的，该主链赋予nir-ii发射体j聚集。这肯定会丰富j-聚集体库，并激励该领域的进一步发展。先前报道的nir-ii发射bt衍生物主要基于具有供体-受体-供体（d-a-d）构型的苯并双噻二唑（bbtd）核（图s1，支持信息）。相比之下，目前新开发的具有d-a配置的bt核心将为nir-ii发射器设计提供新的见解。
方案1. 用于光电疗法的bt分子设计和j型bt6 np的示意图。a） bt分子的化学结构和相应的吸收/发射谱，显示bt6分子在300nm以上的斯托克斯位移增加。b） bt np的制备及其在聚集体中的排放行为。c） 通过jablonski图和体内nir-ii生物成像和成像引导的癌症光疗描述bt6单体和j聚集np的光物理机制。abs：吸收。em：排放。isc：系统间交叉。m：单体。j：j型骨料。fli：荧光成像。pdt：光动力疗法。ptt：光热疗法。
2.结果
2.1 bt分子的设计、合成和表征。
新分子bt6被设计为在bt3的二聚胺和苯并[c]噻吩之间具有邻位二甲基亚苯基桥，以探索延伸供体链段和空间扭曲构象对光物理性质以及分子间相互作用的影响。支持信息中描述了bt6的合成。三芳基胺1是通过4-溴-2,3-二甲ji苯胺和4-碘甲苯的典型pd催化的c-n键偶联反应以65%的产率获得的。在pd（pph3）2cl2作为催化剂的存在下，1和2的stille偶联反应得到产物3，其用于原位制备锡基中间体4，方法是用四丁基氟化铵（tabf）处理以去除tips基团，然后加入n-buli进行去质子化，然后用bu3sncl进行锡基化。4和醛5之间的stille偶联反应得到醛6，醛6通过knöevenagel缩合进一步转化为bt6。详细的合成程序和结构特征见支持信息（图s2-s5，支持信息）。bt3的合成过程和结构特征可以在以前的工作中找到。
首先对bt3和bt6分子进行密度泛函理论（dft）和时间相关dft（td-dft）模拟，以了解它们的光物理性质。图1显示了他们计算的zui gao占据分子轨道（homo）、zui di未占分子轨道（lumo）和优化的几何结构。在bt6中，homo定位在富电子的三芳基胺（taa）供体上，lumo分布在缺电子的受体上。相反，在bt3中，homo和lumo电子密度分布在整个分子骨架上。bt6中d和a之间较大的空间位阻导致61.8°的大二面角和分离良好的边界轨道。这些给出了0.35 ev的小δest，这应该有利于提高其在光动力治疗（pdt）中的性能（图s6，支持信息）。此外，与bt3（信通技术的49%）相比，bt6拥有更高效的信通技术（占信通技术的93.6%）。因此，bt6在四氢呋喃（thf）中的斯托克斯位移为326 nm，比bt3（156 nm）大得多（图s7，支持信息）。他们优化的基态（s0）和di yi单线态激发态。
图1. bt分子的理论模拟。bt3和bt6分子的供体（红色）-受体（蓝色）结构以及相应计算的homos/lumo，homo的ict百分比→lumo跃迁，以及s0和s1状态下优化的分子几何结构与均方根位移（rmsd）之间的比较。（s1）几何形状也在图1中进行了比较。在1.234和1.141的大均方根位移（rmsd）值的激励下，有明显的几何变化Å 分别用于bt3和bt6。这种几何弛豫提供了用于在去激发时产生热量的通道，这对于光热治疗（ptt）是有益的。
2.2 聚合状态下的聚合行为
疏水分子通常被组装成水分散性纳米颗粒，以提高其胶体稳定性和体内循环时间。由于激子动力学的改变，最初的单体财产经常在共组装时发生改变。因此，需要对聚集体的财产有一个清晰的了解，以便其进一步的生物医学应用。为了研究bt3和bt6分子在聚集态下的荧光财产，测量了不同水含量（fw）的thf/水混合物的光致发光（pl）光谱。如图2a和图s8a（支持信息）所示，bt3在纯thf中溶解时具有较强的发射。随着fw从0%增加到60%，其发射强度略有上升。当fw进一步增加到70%及以上时，bt3的发射强度由于聚集体的形成而急剧降低，表明其acq特性。相比之下，bt6显示出不同的发射行为，如图2a和图s8b所示（支持信息）。当bt6溶解在0-60%fw的thf/水混合物中时，它几乎是不发射的，因为它以单体状态存在，并且taa转子可以自由旋转。有趣的是，发射强度随着fw的进一步升高而增加，达到70%及以上。由于转子整体旋转的限制，荧光增强，证明了其aie特性。从acq（bt3）到aie（bt6）的荧光行为的改变有利于有效的体内生物成像。为了追溯这种变化的原因，对它们的分子结构进行了综述。如图1所示，bt3显示d和a之间的二面角为36.5°。相比之下，bt6具有更长的主链和更扭曲的结构，taa和bt基团之间的二面角为61.8°，两个bt基团之间为42°。bt6中的这种扭曲结构是由于在亚苯基上引入了两个甲基，这在很大程度上增加了分子内的空间位阻。扭曲的几何形状防止bt6在聚集时面对面π-π堆积，从而保留其nir-ii荧光。值得注意的是，尽管最近有几篇关于在d-a-d型分子中将nir-ii排放从acq转化为aie的报道；到目前为止，还没有关于简单的d-a分子的这样的报道。更有趣的是，值得注意的是，从未报道过对j聚集系统的聚集物排放行为的这种操纵。
为了更好地理解bt6分子的聚集行为，研究了bt6在不同fw的thf/水混合物中的吸收。如图2b所示，当fw从0增加到99%时，bt6红的吸收峰从627 nm移动到653 nm，在700 nm以上的区域出现吸收肩。结果表明，bt6单体形成j聚集体，在聚集体状态下具有红移吸收的特征。为了进一步阐明bt6的聚集特征，通过与美国fda批准的pluronic f127（聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷，peo-ppo-peo）共组装来制备水分散性纳米颗粒。这种共聚物辅助的纳米组装体可以增强体内生物相容性和肿瘤积聚。同时，还制备了bt6纯膜和单晶，以全面研究其聚集财产。如图2c所示，与thf中的游离bt6单体相比，吸收峰和发射峰都显示出不同水平的红移。np的吸收zui da值移动到652nm，这与在thf/水混合物中形成的聚集体中观察到的现象一致。该结果还表明bt6的这种j型聚集是相对稳定的，并且不受在聚集物中包括peo-ppo-peo的影响。bt6薄膜在687nm处具有更大的红移吸收zui da值。来自np分散体的发射显示出类似的红移。在固态发射中，晶体具有比膜态更长的波长pl峰值，这可能是由于其更规则的j型堆叠。bt6的这种红移吸收和发射可以提供深层组织穿透、低组织损伤和改善体内应用的生物成像性能。
图2.bt聚集体的聚集行为和光谱特征。a） bt3和bt6在具有不同水分数的thf/水混合物中的光致发光强度（i/i0）的变化。插图：bt3和bt6在含0和90%水馏分的thf/水混合物中的nir-ii荧光图像。b） bt6在具有不同水分数的thf/水混合物中的吸收光谱。c） 不同j型bt6聚集体的吸收光谱和荧光光谱。d）bt6的x射线晶体结构。e） bt6晶体中具有滑移角和分子间距离的分子堆积模式。为了清楚起见，省略了溶剂分子。f） 计算晶体中bt6分子的静电势表面。g） 计算晶体中bt6二聚体的非共价相互作用。
然后通过单晶结构分析研究bt6中的分子堆积模式（图2d、图s9和表s1，支持信息）。bt6单晶表现出三斜结构（空间群：p-1）。如图2e和图s10（支持信息）所示，bt6二聚体显示出典型的滑移堆积，分子间距离为3.5å，滑移角为17°，小于j型填料所需的魔角54.7°。[16] bt6的计算静电势（esp）图表明，负π-电荷主要分布在氰基的氮原子上，而正π-电荷则主要分布在另一部分（图2f）。此外，供体具有扭曲的结构，该结构具有大的空间位阻，因此不能容易地与相邻分子包装。因此，bt6倾向于通过静电相互作用通过两个单体的平面受体部分堆积在一起，产生bt6二聚体（图2e）。对bt6晶体二聚体进行了进一步的理论计算，以探索分子间的相互作用。如图2g和图s11（支持信息）所示，相邻分子主要通过晶体二聚体内的范德华力和空间效应相互作用。据我们所知，到目前为止，nir-ii发射j聚集染料都是基于三种传统j型主链之一：花青、方碱或bodipy（表s2，支持信息）。因此，值得注意的是，这项工作报道了一种新型的分子骨架，用于设计具有j聚集的nir-ii发射体。
2.3 bt np的光物理性质
对bt3和bt6纳米颗粒进行表征，以探索其光物理性质。如图3a所示，bt3纳米颗粒的尺寸为38纳米，而bt6纳米颗粒的大小为44纳米，这也通过使用透射电子显微镜（tem）得到了证实。它们相应的np水分散体既透明又透明，说明它们具有良好的胶体稳定性。通过在室温下记录一个月的粒径，进一步验证了bt6 np的胶体稳定性，结果表明，在整个测试期间，粒径保持不变（图s12，支持信息）。由于pluronic f127共聚物的存在，bt3和bt6 np都具有负ζ电位（图s13，支持信息）。进一步表征了bt3和bt6 np在水中的吸收光谱和荧光光谱。如图3b所示，bt6分子显示出比bt3分子更短的波长吸收，而它们的发射位于900nm以外的相同区域，这表明bt6分子的斯托克斯位移为326nm。与thf中的单体相比，bt3和bt6 np的吸收和发射波长都显示出明显的红移。特别是，在形成j型np后，bt6在808nm处的吸收被有效地增强了~41倍，这有利于nir 808nm激光激发。从单体溶液和相应的np分散体之间的颜色变化也可以观察到这些有趣的吸光度变化（图s14，支持信息）。此外，bt3和bt6的发射峰在形成np后都延伸到1050nm以上，这有利于体内生物成像。值得注意的是，bt6的斯托克斯位移在形成np后增加到402nm，这可以zui da限度地减少荧光的自猝灭。先前报道的具有大斯托克斯位移的nir-ii发射器总结在表s3中（支持信息）。据我们所知，bt6 np在具有明亮nir-ii荧光的有机分子中显示出最长的斯托克斯位移。此外，bt6 np作为自由分子重新溶解在thf中，以证明其在形成np后的稳定性。如图s15所示（支持信息），分解的bt6的吸收峰与thf中的游离bt6分子一致，验证了其在np制备过程中的化学特性不变。
图3. bt np的光物理财产。a） bt3和bt6 np的尺寸分布。左侧插图：bt3和bt6 np水分散体。右插图：bt6纳米颗粒的tem图像。比例尺：100纳米。b） thf中bt3和bt6分子及其相应np在水中的归一化吸收和发射光谱。c） 具有不同长通（lp）滤光片的bt3 np（100μg ml-1）、bt6分子（100μgml-1）和bt6 np（100微克ml-1）的nir-ii荧光图像。激发源：808nm激光。d） nir-ii荧光强度与bt6 nps浓度之间的定量关系（n=4）。插图：不同浓度的bt6 np的nir-ii荧光图像。激发源：808nm激光。e） ir1061（在dcm中）、bt3分子（在thf中）、bt3 np（在水中）和bt6 np（在水中）在808nm处具有五个光密度（od）值的积分光致发光（pl）强度的图，以及它们相应的光致发光量子产率。f） 在808nm激光照射（0.33w cm-2）0至10分钟（n=4）的情况下，水中bt6 np和icg的相对nir-ii荧光强度变化。插图：具有不同照射持续时间的bt6 np和icg的nir-ii荧光图像。g） 在808nm激光（0.1w cm-2）照射10分钟下，水中bt6 np和icg的ros产生。指示剂：dcfh。h） 不同浓度（0、30、60、90、120μg ml-1）的bt6 np在808 nm激光（1 w cm-2）照射5分钟后的红外热像图。数据以平均值±标准偏差表示。
使用880和1000nm长通（lp）滤光片记录bt3 np、bt6分子和bt6 np的荧光图像，以研究成像性能（图3c）。由于acq特征，bt3 np在这两种情况下几乎没有显示荧光，而bt6 np即使使用880nm和1000nm lp滤光片也具有强烈的聚集诱导荧光，证明了nirii生物成像的潜力。如图s16（支持信息）所示，bt在不同介质中的荧光性能没有明显变化。可能的原因是np中的分子已经与聚合物基质组装在一起，其中基质限制了分子的运动，避免了与周围介质的接触。在808nm激光激发下，进一步测量了不同浓度的bt6 np分散体的发射强度（图3d）。结果表明，bt6 np的nir-ii荧光信号随着浓度的增加而线性增加，说明了定量成像的能力。然后，通过将bt3和bt6材料的nir-ii光致发光量子产率（plqy）与作为标准参考的ir1061材料（plqy:1.70%在dcm中）进行比较来评估它们。如图3e和图s17（支持信息）所示，bt3在thf中显示出1.88%的良好plqy，而其在水中的np由于猝灭效应而具有0.03%的非常低的plqy。bt6分子在thf中的plqy无法评估，因为其在808nm处的吸光度较差。相反，水中的bt6 np在808nm激光激发下具有0.97%的高plqy，这适合于体内生物成像。此外，通过使用吲哚菁绿（icg，fda批准的nir荧光成像染料）作为808nm激光照射下的比较，研究了bt6 np的荧光稳定性。如图3f所示，bt6 np的荧光强度在照射10分钟后略有下降16.0%，而icg仅在照射6分钟后就迅速降解96.4%。结果表明，bt6 np的光稳定性比临床使用的成像染料好得多，这表明bt6 np适用于体内生物成像。
由于bt6具有低δest，它可能产生用于肿瘤pdt的细胞毒性ros。使用2′，7′-二氯荧光素（dcfh）作为荧光探针，进一步评估了近红外激活的bt6 np的ros产生。如图3g和图s18（支持信息）所示，bt6 np在808nm辐射下具有良好的ros生成，这是水中icg的17倍。如图3h和图s19（支持信息）所示，bt6 np在808nm激光激发下也表现出良好的光热性能。当浓度为120μg ml-1时，nps水分散体的温度在照射5分钟后迅速升高，达到约60℃的高温，远远超过癌症细胞坏死所需的温度（42℃）。在水组中几乎没有温度升高，这表明808nm的水的光的吸收是最小的，因此引起最小的组织损伤。bt6 np的光热转换效率（pce，η）进一步确定为36%（图s20，支持信息），验证了良好的光热效应。表s4总结了bt3和bt6单体及其np的关键光物理参数（支持信息）。利用飞秒瞬态（fs-ta）光谱测量方法研究了bt6的激发态动力学。bt6分子在thf中在580-620nm处的动力学曲线显示，在13.9ps处有一个衰变组分（图s21和表s5，支持信息）。这种相对短寿命的衰变分量与报道的非辐射衰变寿命相匹配。还研究了水中bt6 np的fs-ta光谱（图s22，支持信息）。聚集bt6分子后产生新的成分。其中，超快的两种衰变（0.08ps和3.02ps）是非辐射衰变成分，属于光热效应。75.5ps的相对长寿命组分是1o2生成的荧光通道和三重态激发态，这在游离bt6分子中是不存在的。因此，分子的聚集产生了具有长寿命的新通道，用于产生nir-ii荧光和1o2。
此外，通过记录加热/冷却循环，研究了bt6 np的光热稳定性。如图s23（支持信息）所示，在5个辐照周期后，bt6 np的温度仅略有下降，而在相同条件下，icg的温度衰减严重。在一个月的储存期内，bt6 np的吸光度变化可以忽略不计，这也证明了长期储存的稳定性（图s24，支持信息）。许多报道的j聚集体仅在室温下的特定溶剂环境中具有稳定性，并且可能在包括蛋白质在内的生理溶液中由于分子间相互作用或高温而被破坏。因此，进一步研究了bt6 np在dulbecco改良eagle培养基（dmem）和人血清白蛋白（hsa）混合物中的稳定性。如图s25（支持信息）所示，即使在37℃下孵育48小时，bt6 np在dmem/hsa混合物中的吸收也仅略有下降，证明了稳定的j型聚集。因此，这些结果表明，bt6-np是一种优越的光疗剂，可用于进一步的体外试验。
图4. bt6纳米颗粒的体外光疗性能。a） 不同条件下4t1细胞中ros生成的共聚焦荧光图像。探针：dcfh-da用于ros染色，hoechst 33342用于细胞核染色。比例尺：50μm。b） 不同处理后用钙黄绿素am和同二聚乙锭-1染色的a549细胞的共聚焦荧光图像。比例尺：100μm。c） 4t1和d）a549细胞在808nm激光（1w cm-2）处理9分钟（n=4）下的bt6 np浓度依赖性生存能力。数据以平均值±标准差表示。
2.4 体外活性氧评价与抗癌性能
使用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（dcfh-da）作为ros探针检测细胞内ros的产生，同时用hoechst 33342染料对细胞核进行染色。如图4a和图s26（支持信息）所示，仅pbs组、pbs+激光组和仅bt6 nps组的4t1癌症细胞没有显示ros氧化的2'，7'-二氯荧光素（dcf）的绿色荧光信号，表明细胞内没有ros生成。相比之下，激光照射组的bt6 np中的4t1细胞显示出随着照射时间的推移逐渐增加的绿色荧光。bt6 np的细胞内ros生成能力也在a549和hela细胞中进行了评估，显示出与4t1细胞系相同的结果（图s27和s28，支持信息）。这些结果表明，bt6np在激光照射下可以进入多种癌症细胞并有效地产生活性氧。通过活/死细胞染色进一步研究bt6 nps的抗癌性能，其中绿色钙黄绿素am染色活细胞的细胞质，而红色乙炔同二聚体-1染色死细胞的细胞核。如图4b所示，仅pbs组、pbs+激光组和仅bt6 nps组的细胞质内观察到亮绿色荧光，表明这些组没有抗癌作用。相比之下，bt6 nps+激光组的细胞核内观察到亮红色荧光，说明其具有优异的光动力和光热抗癌性能。还使用4t1和a549癌症细胞系进行了标准mtt检测，以证明bt6 nps的细胞杀伤性能。如图4c所示，当在808nm激光照射下与50μg ml-1的bt6 np孵育时，4t1细胞显示出显著降低的生存能力，降至约6%。相反，在仅bt6 np组中，4t1细胞活力仅显示出轻微下降至87%。同样，bt6 nps+激光组a549癌症细胞的存活率也较低，而仅nps组保持良好的细胞存活率（图4d）。这些结果表明，bt6纳米粒可用于不同癌症细胞的近红外光激活光疗，具有低暗毒性，可用于生物医学应用。
2.5 体内nir-ii荧光成像
图5. 血管和肿瘤的体内nir-ii荧光成像。a） 使用bt6 np进行全身血管成像，bt6 np具有不同的高通滤波器和相应的半zui da全宽分析。激发源：793nm激光。比例尺：20mm。b）体内nir-ii荧光图像和c）静脉注射bt6 np后4t1荷瘤小鼠在0、3、6、12、24、36、48、72、，和96小时。d）离体nir-ii荧光图像和e）在注射bt6 np后36小时从4t1荷瘤小鼠切除的不同器官和肿瘤的相应荧光强度（n＝3）。激发源：808nm激光。数据以平均值±标准差表示。
由于bt6 np具有优异的nir-ii发射，因此使用ingaas探测器进行全身血管成像以评估大深度成像性能。如图5a所示，注射bt6 np后，小鼠的血管可以被识别。值得注意的是，与使用900nm lp滤波器拍摄的成像图像相比，使用1300nm和1100nm lp滤波器的成像图像显示出显著改善的对比度和明显减少的背景干扰。同时，绘制血管的nir ii荧光强度以展示横截面强度分布。很明显，半峰全宽（fwhm）从使用900nm lp滤波器的0.49mm减小到使用1300nm lp滤光片的0.38mm，验证了通过使用更长波长成像增强的成像分辨率。
nir-ii荧光成像也可用于指导体内光疗，以优化治疗效果。如图5b所示，在注射bt6 np后的不同时间点收集4t1荷瘤裸鼠的体内nir-ii荧光图像。肿瘤部位的荧光强度随着时间的推移而增强，并在注射后36小时达到zui da值，这可以作为zui jia光疗传导时间点（图5c）。此外，在注射后36小时从小鼠身上切除主要器官和肿瘤组织，以进行离体荧光成像。如图5d和e所示，nir-ii荧光信号主要分布在肝脏和肿瘤组织中，表明bt6 np可以在肿瘤部位积累。
2.6 体内光疗疗效
良好的体外实验结果鼓励我们通过使用bt6 np进一步进行体内光疗。通过使用静脉注射bt6 np的4t1荷瘤裸鼠，然后在注射后36小时进行808nm激光激发，来研究体内光治疗性能。使用红外热成像相机记录bt6 np肿瘤部位的光致发热。如图6a和图b所示，在5分钟808nm光照射下，仅pbs组的温度仅略有升高3.4°c。相反，在相同的处理条件下，bt6 np组可以观察到温度迅速升高到50°c左右，这对于光热处理来说足够高。如图6c、d和图s29（支持信息）所示，由于光诱导的ros和bt6 np的发热，bt6 nps+激光组显示出显著的肿瘤去除效果。与pbs对照组相比，pbs+激光和仅bt6 np组中的小鼠肿瘤显示出相似的大小，这意味着仅激光治疗或仅注射np不能提供抗肿瘤效果。还通过测量从治疗开始的肿瘤体积来记录整个治疗期。如图6e所示，bt6 nps+激光组小鼠的肿瘤生长在前两天的光疗治疗后得到有效抑制，在接下来的12天内没有明显的复发。然而，pbs、pbs+激光和仅bt6 np组中的肿瘤在整个两周的治疗期间显示出持续生长。此外，每2天记录不同组小鼠的体重，以研究治疗的体内毒性。不同组的所有小鼠体重相似，在治疗过程中略有增加，这在一定程度上意味着bt6 np的生物安全性（图6f）。
图6. bt6 np对4t1荷瘤小鼠的体内光疗性能。a） 红外热图像和b）在注射pbs或bt6 np后36小时，用808nm激光照射不同时间的4t1荷瘤小鼠的相应温度分布。激发源：808nm激光，1 w cm-2。c） 小鼠和d）不同治疗组在第14天的肿瘤图像。e） 不同治疗组14天的肿瘤生长曲线（n=5）。f） 治疗期间不同治疗组的小鼠体重（n=5）。g） h&e和tunel染色。比例尺：200μm。数据以平均值±标准差表示。p值通过使用tukey检验的单因素方差分析计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.00
为了进一步研究治疗的疗效和生物相容性，系统地进行了组织学染色和血液分析。如图6g所示，bt6 nps+激光组的肿瘤组织苏木精和伊红（h&e）染色显示，肿瘤细胞严重破坏，坏死明显，这在其他组中没有发现。末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记（tunel）结果进一步说明了bt6 nps+激光组中癌症细胞的明显凋亡，这在其他组中没有观察到。这些结果证实了808nm激光照射的bt6 np可导致严重的肿瘤细胞死亡。此外，还对用各种制剂处理的小鼠的各种器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行h&e染色。如图s30（支持信息）所示，特定器官的所有染色组都显示出相似的结果，反映出没有明显的器官损伤。最后，从四组小鼠中采集血液，进行血液生物化学和完整的血型分析。如图s31（支持信息）所示，bt6 nps+激光组的所有测量参数与其他组相比均无显著差异，表明肝毒性和肾毒性可忽略不计。此外，两组的完整血液参数也显示出相似的结果，进一步验证了bt6 np的体内生物安全性（图s32，支持信息）。
3.结论
总之，我们开发了一种新型的nir-ii放射j聚集纳米粒子（bt6 np），具有抗猝灭财产，用于高效的体内生物成像和癌症光热研究。分子设计策略可以同时实现大的斯托克斯位移和aie效应。这两个特征有效地解决了先前报道的nir-ii j聚集体的猝灭问题，并在bt6 np中提供超过1050nm的明亮发射和402nm的大斯托克斯位移。此外，bt6np还可以在808nm激光照射下产生ros和热量，用于癌症光疗。体内实验全面证明bt6 nps是nir-ii荧光成像和成像引导癌症光疗的优秀试剂。因此，本研究说明了具有精确调谐光物理财产的j聚集nir-ii发射器的设计范例。我们预计，这种策略将为构建用于生物成像应用的明亮nir-ii发射j聚集体铺平道路。
参考文献
lee, k. w., gao, y., wei, w. c., tan, j. h., wan, y., feng, z., et al. (2023). anti-quenching nir-ii j-aggregates of benzo[c]thiophene fluorophore for highly efficient bioimaging and phototheranostics. adv mater, e2211632.
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1.简介：
在过去的十年里，第二近红外窗口（nir-ii，900-1700 nm）中的荧光生物成像由于其高分辨率、低组织自发荧光以及深组织穿透性，在生物医学领域具有很大的前景。目前，许多nir-ii荧光材料，如量子点、碳纳米管、稀土掺杂纳米颗粒（np）和有机小分子已经成功构建。其中，共轭小分子由于其优越的生物相容性和强的近红外（nir）吸收，在体内医学诊断和光疗方面表现出非凡的优势。然而，它们的实际应用往往因荧光亮度不令人满意而受到阻碍。
与单体状态相比，j聚集体显示出红移的吸收和发射带，这可用于开发高效的nir-ii发射体。然而，大多数报道的荧光团在形成纳米颗粒后显示出h型或无序聚集，由于其刚性和平面分子结构，近红外吸收和荧光性能减弱。只有少数类型的荧光团具有j型填充特性，如二吡咯甲ji硼（bodipy）、花青、方胺和苝双酰亚胺。最近，基于传统的j型分子骨架开发了几种nir-ii发射j聚集体。它们的吸收和发射带红移到更长的波长区域，这有利于体内生物成像。尽管如此，j-聚集体在nir-ii荧光成像中的广泛应用受到j-型主链种类有限的阻碍。此外，由于难以避免的自猝灭效应，先前报道的nir-ii j聚集体的荧光产率对于实现有效的生物成像是不令人满意的。因此，强烈需要开发用于nir-ii荧光成像的具有明亮荧光的新型j型发射材料。
自猝灭效应是影响近红外荧光团成像性能的主要问题之一。例如，花青和方酸染料的斯托克斯位移通常低于100nm，这导致它们发射的光子的不可避免地被自吸收。此外，由于聚集引起的猝灭（acq）效应，许多报道的具有疏水性特征的nir-ii小分子在形成水分散性纳米颗粒时往往显示出严重降低的亮度。因此，开发具有抗猝灭能力的nir-ii荧光团对于实现高质量的体内生物成像具有重要意义。据我们所知，由于缺乏合适的分子主干和实现抗猝灭能力的问题，此类j聚集体尚未报道。
作为概念验证，我们首先制备了苯并[c]噻吩（bt）基衍生物bt3，这在我们之前的研究中有报道。[47]由于强烈的电子推拉效应，它表现出强烈的di yi近红外（nir-i，700-900nm）吸收和nir-ii发射，斯托克斯位移为156nm。在水中形成纳米聚集体后，bt3 np在吸收和发射方面表现出有趣的红移，说明了j聚集特性。然而，bt3单体的明亮荧光由于acq效应而被严重猝灭。然后，我们在苯并[c]-噻吩和bt3的二聚胺之间引入二甲基亚苯基，以产生具有较大结构畸变的bt6分子。由于延长的供体和增加的供体-受体（d-a）构象扭曲，分子内电荷转移（ict）效应大大改善，这将bt6的斯托克斯位移延长到326 nm（方案1）。在形成水分散性np后，bt6 np显示出优选的j型聚集，其提供红移吸收，并且808nm处的吸光度从其分离的分子增加了41倍。此外，由于聚集诱导发射（aie）效应，nir-ii荧光增强了26倍，峰值从953 nm红移到1054 nm。因此，我们的分子设计策略可以同时实现两个目标：增加的斯托克斯位移和aie效应，这可以有效地解决荧光团的自猝灭问题。同时，bt6np在808nm激光照射下可产生大量活性氧（ros）和放热来用于癌症光疗。所开发的bt6 np成功应用于全身血管的nir-ii荧光成像和成像引导的小鼠肿瘤光疗。总之，本研究通过调节stokes位移和聚集体的发射行为，构建了一个明亮的苯并噻吩j聚集体，用于体内nir-ii生物成像和癌症热分析，同时为合理设计具有抗猝灭性能的荧光团提供了范例。更重要的是，bt6分子是用一种新型的d-a配置的主链构建的，该主链赋予nir-ii发射体j聚集。这肯定会丰富j-聚集体库，并激励该领域的进一步发展。先前报道的nir-ii发射bt衍生物主要基于具有供体-受体-供体（d-a-d）构型的苯并双噻二唑（bbtd）核（图s1，支持信息）。相比之下，目前新开发的具有d-a配置的bt核心将为nir-ii发射器设计提供新的见解。
方案1. 用于光电疗法的bt分子设计和j型bt6 np的示意图。a） bt分子的化学结构和相应的吸收/发射谱，显示bt6分子在300nm以上的斯托克斯位移增加。b） bt np的制备及其在聚集体中的排放行为。c） 通过jablonski图和体内nir-ii生物成像和成像引导的癌症光疗描述bt6单体和j聚集np的光物理机制。abs：吸收。em：排放。isc：系统间交叉。m：单体。j：j型骨料。fli：荧光成像。pdt：光动力疗法。ptt：光热疗法。
2.结果
2.1 bt分子的设计、合成和表征。
新分子bt6被设计为在bt3的二聚胺和苯并[c]噻吩之间具有邻位二甲基亚苯基桥，以探索延伸供体链段和空间扭曲构象对光物理性质以及分子间相互作用的影响。支持信息中描述了bt6的合成。三芳基胺1是通过4-溴-2,3-二甲ji苯胺和4-碘甲苯的典型pd催化的c-n键偶联反应以65%的产率获得的。在pd（pph3）2cl2作为催化剂的存在下，1和2的stille偶联反应得到产物3，其用于原位制备锡基中间体4，方法是用四丁基氟化铵（tabf）处理以去除tips基团，然后加入n-buli进行去质子化，然后用bu3sncl进行锡基化。4和醛5之间的stille偶联反应得到醛6，醛6通过knöevenagel缩合进一步转化为bt6。详细的合成程序和结构特征见支持信息（图s2-s5，支持信息）。bt3的合成过程和结构特征可以在以前的工作中找到。
首先对bt3和bt6分子进行密度泛函理论（dft）和时间相关dft（td-dft）模拟，以了解它们的光物理性质。图1显示了他们计算的zui gao占据分子轨道（homo）、zui di未占分子轨道（lumo）和优化的几何结构。在bt6中，homo定位在富电子的三芳基胺（taa）供体上，lumo分布在缺电子的受体上。相反，在bt3中，homo和lumo电子密度分布在整个分子骨架上。bt6中d和a之间较大的空间位阻导致61.8°的大二面角和分离良好的边界轨道。这些给出了0.35 ev的小δest，这应该有利于提高其在光动力治疗（pdt）中的性能（图s6，支持信息）。此外，与bt3（信通技术的49%）相比，bt6拥有更高效的信通技术（占信通技术的93.6%）。因此，bt6在四氢呋喃（thf）中的斯托克斯位移为326 nm，比bt3（156 nm）大得多（图s7，支持信息）。他们优化的基态（s0）和di yi单线态激发态。
图1. bt分子的理论模拟。bt3和bt6分子的供体（红色）-受体（蓝色）结构以及相应计算的homos/lumo，homo的ict百分比→lumo跃迁，以及s0和s1状态下优化的分子几何结构与均方根位移（rmsd）之间的比较。（s1）几何形状也在图1中进行了比较。在1.234和1.141的大均方根位移（rmsd）值的激励下，有明显的几何变化Å 分别用于bt3和bt6。这种几何弛豫提供了用于在去激发时产生热量的通道，这对于光热治疗（ptt）是有益的。
2.2 聚合状态下的聚合行为
疏水分子通常被组装成水分散性纳米颗粒，以提高其胶体稳定性和体内循环时间。由于激子动力学的改变，最初的单体财产经常在共组装时发生改变。因此，需要对聚集体的财产有一个清晰的了解，以便其进一步的生物医学应用。为了研究bt3和bt6分子在聚集态下的荧光财产，测量了不同水含量（fw）的thf/水混合物的光致发光（pl）光谱。如图2a和图s8a（支持信息）所示，bt3在纯thf中溶解时具有较强的发射。随着fw从0%增加到60%，其发射强度略有上升。当fw进一步增加到70%及以上时，bt3的发射强度由于聚集体的形成而急剧降低，表明其acq特性。相比之下，bt6显示出不同的发射行为，如图2a和图s8b所示（支持信息）。当bt6溶解在0-60%fw的thf/水混合物中时，它几乎是不发射的，因为它以单体状态存在，并且taa转子可以自由旋转。有趣的是，发射强度随着fw的进一步升高而增加，达到70%及以上。由于转子整体旋转的限制，荧光增强，证明了其aie特性。从acq（bt3）到aie（bt6）的荧光行为的改变有利于有效的体内生物成像。为了追溯这种变化的原因，对它们的分子结构进行了综述。如图1所示，bt3显示d和a之间的二面角为36.5°。相比之下，bt6具有更长的主链和更扭曲的结构，taa和bt基团之间的二面角为61.8°，两个bt基团之间为42°。bt6中的这种扭曲结构是由于在亚苯基上引入了两个甲基，这在很大程度上增加了分子内的空间位阻。扭曲的几何形状防止bt6在聚集时面对面π-π堆积，从而保留其nir-ii荧光。值得注意的是，尽管最近有几篇关于在d-a-d型分子中将nir-ii排放从acq转化为aie的报道；到目前为止，还没有关于简单的d-a分子的这样的报道。更有趣的是，值得注意的是，从未报道过对j聚集系统的聚集物排放行为的这种操纵。
为了更好地理解bt6分子的聚集行为，研究了bt6在不同fw的thf/水混合物中的吸收。如图2b所示，当fw从0增加到99%时，bt6红的吸收峰从627 nm移动到653 nm，在700 nm以上的区域出现吸收肩。结果表明，bt6单体形成j聚集体，在聚集体状态下具有红移吸收的特征。为了进一步阐明bt6的聚集特征，通过与美国fda批准的pluronic f127（聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷，peo-ppo-peo）共组装来制备水分散性纳米颗粒。这种共聚物辅助的纳米组装体可以增强体内生物相容性和肿瘤积聚。同时，还制备了bt6纯膜和单晶，以全面研究其聚集财产。如图2c所示，与thf中的游离bt6单体相比，吸收峰和发射峰都显示出不同水平的红移。np的吸收zui da值移动到652nm，这与在thf/水混合物中形成的聚集体中观察到的现象一致。该结果还表明bt6的这种j型聚集是相对稳定的，并且不受在聚集物中包括peo-ppo-peo的影响。bt6薄膜在687nm处具有更大的红移吸收zui da值。来自np分散体的发射显示出类似的红移。在固态发射中，晶体具有比膜态更长的波长pl峰值，这可能是由于其更规则的j型堆叠。bt6的这种红移吸收和发射可以提供深层组织穿透、低组织损伤和改善体内应用的生物成像性能。
图2.bt聚集体的聚集行为和光谱特征。a） bt3和bt6在具有不同水分数的thf/水混合物中的光致发光强度（i/i0）的变化。插图：bt3和bt6在含0和90%水馏分的thf/水混合物中的nir-ii荧光图像。b） bt6在具有不同水分数的thf/水混合物中的吸收光谱。c） 不同j型bt6聚集体的吸收光谱和荧光光谱。d）bt6的x射线晶体结构。e） bt6晶体中具有滑移角和分子间距离的分子堆积模式。为了清楚起见，省略了溶剂分子。f） 计算晶体中bt6分子的静电势表面。g） 计算晶体中bt6二聚体的非共价相互作用。
然后通过单晶结构分析研究bt6中的分子堆积模式（图2d、图s9和表s1，支持信息）。bt6单晶表现出三斜结构（空间群：p-1）。如图2e和图s10（支持信息）所示，bt6二聚体显示出典型的滑移堆积，分子间距离为3.5å，滑移角为17°，小于j型填料所需的魔角54.7°。[16] bt6的计算静电势（esp）图表明，负π-电荷主要分布在氰基的氮原子上，而正π-电荷则主要分布在另一部分（图2f）。此外，供体具有扭曲的结构，该结构具有大的空间位阻，因此不能容易地与相邻分子包装。因此，bt6倾向于通过静电相互作用通过两个单体的平面受体部分堆积在一起，产生bt6二聚体（图2e）。对bt6晶体二聚体进行了进一步的理论计算，以探索分子间的相互作用。如图2g和图s11（支持信息）所示，相邻分子主要通过晶体二聚体内的范德华力和空间效应相互作用。据我们所知，到目前为止，nir-ii发射j聚集染料都是基于三种传统j型主链之一：花青、方碱或bodipy（表s2，支持信息）。因此，值得注意的是，这项工作报道了一种新型的分子骨架，用于设计具有j聚集的nir-ii发射体。
2.3 bt np的光物理性质
对bt3和bt6纳米颗粒进行表征，以探索其光物理性质。如图3a所示，bt3纳米颗粒的尺寸为38纳米，而bt6纳米颗粒的大小为44纳米，这也通过使用透射电子显微镜（tem）得到了证实。它们相应的np水分散体既透明又透明，说明它们具有良好的胶体稳定性。通过在室温下记录一个月的粒径，进一步验证了bt6 np的胶体稳定性，结果表明，在整个测试期间，粒径保持不变（图s12，支持信息）。由于pluronic f127共聚物的存在，bt3和bt6 np都具有负ζ电位（图s13，支持信息）。进一步表征了bt3和bt6 np在水中的吸收光谱和荧光光谱。如图3b所示，bt6分子显示出比bt3分子更短的波长吸收，而它们的发射位于900nm以外的相同区域，这表明bt6分子的斯托克斯位移为326nm。与thf中的单体相比，bt3和bt6 np的吸收和发射波长都显示出明显的红移。特别是，在形成j型np后，bt6在808nm处的吸收被有效地增强了~41倍，这有利于nir 808nm激光激发。从单体溶液和相应的np分散体之间的颜色变化也可以观察到这些有趣的吸光度变化（图s14，支持信息）。此外，bt3和bt6的发射峰在形成np后都延伸到1050nm以上，这有利于体内生物成像。值得注意的是，bt6的斯托克斯位移在形成np后增加到402nm，这可以zui da限度地减少荧光的自猝灭。先前报道的具有大斯托克斯位移的nir-ii发射器总结在表s3中（支持信息）。据我们所知，bt6 np在具有明亮nir-ii荧光的有机分子中显示出最长的斯托克斯位移。此外，bt6 np作为自由分子重新溶解在thf中，以证明其在形成np后的稳定性。如图s15所示（支持信息），分解的bt6的吸收峰与thf中的游离bt6分子一致，验证了其在np制备过程中的化学特性不变。
图3. bt np的光物理财产。a） bt3和bt6 np的尺寸分布。左侧插图：bt3和bt6 np水分散体。右插图：bt6纳米颗粒的tem图像。比例尺：100纳米。b） thf中bt3和bt6分子及其相应np在水中的归一化吸收和发射光谱。c） 具有不同长通（lp）滤光片的bt3 np（100μg ml-1）、bt6分子（100μgml-1）和bt6 np（100微克ml-1）的nir-ii荧光图像。激发源：808nm激光。d） nir-ii荧光强度与bt6 nps浓度之间的定量关系（n=4）。插图：不同浓度的bt6 np的nir-ii荧光图像。激发源：808nm激光。e） ir1061（在dcm中）、bt3分子（在thf中）、bt3 np（在水中）和bt6 np（在水中）在808nm处具有五个光密度（od）值的积分光致发光（pl）强度的图，以及它们相应的光致发光量子产率。f） 在808nm激光照射（0.33w cm-2）0至10分钟（n=4）的情况下，水中bt6 np和icg的相对nir-ii荧光强度变化。插图：具有不同照射持续时间的bt6 np和icg的nir-ii荧光图像。g） 在808nm激光（0.1w cm-2）照射10分钟下，水中bt6 np和icg的ros产生。指示剂：dcfh。h） 不同浓度（0、30、60、90、120μg ml-1）的bt6 np在808 nm激光（1 w cm-2）照射5分钟后的红外热像图。数据以平均值±标准偏差表示。
使用880和1000nm长通（lp）滤光片记录bt3 np、bt6分子和bt6 np的荧光图像，以研究成像性能（图3c）。由于acq特征，bt3 np在这两种情况下几乎没有显示荧光，而bt6 np即使使用880nm和1000nm lp滤光片也具有强烈的聚集诱导荧光，证明了nirii生物成像的潜力。如图s16（支持信息）所示，bt在不同介质中的荧光性能没有明显变化。可能的原因是np中的分子已经与聚合物基质组装在一起，其中基质限制了分子的运动，避免了与周围介质的接触。在808nm激光激发下，进一步测量了不同浓度的bt6 np分散体的发射强度（图3d）。结果表明，bt6 np的nir-ii荧光信号随着浓度的增加而线性增加，说明了定量成像的能力。然后，通过将bt3和bt6材料的nir-ii光致发光量子产率（plqy）与作为标准参考的ir1061材料（plqy:1.70%在dcm中）进行比较来评估它们。如图3e和图s17（支持信息）所示，bt3在thf中显示出1.88%的良好plqy，而其在水中的np由于猝灭效应而具有0.03%的非常低的plqy。bt6分子在thf中的plqy无法评估，因为其在808nm处的吸光度较差。相反，水中的bt6 np在808nm激光激发下具有0.97%的高plqy，这适合于体内生物成像。此外，通过使用吲哚菁绿（icg，fda批准的nir荧光成像染料）作为808nm激光照射下的比较，研究了bt6 np的荧光稳定性。如图3f所示，bt6 np的荧光强度在照射10分钟后略有下降16.0%，而icg仅在照射6分钟后就迅速降解96.4%。结果表明，bt6 np的光稳定性比临床使用的成像染料好得多，这表明bt6 np适用于体内生物成像。
由于bt6具有低δest，它可能产生用于肿瘤pdt的细胞毒性ros。使用2′，7′-二氯荧光素（dcfh）作为荧光探针，进一步评估了近红外激活的bt6 np的ros产生。如图3g和图s18（支持信息）所示，bt6 np在808nm辐射下具有良好的ros生成，这是水中icg的17倍。如图3h和图s19（支持信息）所示，bt6 np在808nm激光激发下也表现出良好的光热性能。当浓度为120μg ml-1时，nps水分散体的温度在照射5分钟后迅速升高，达到约60℃的高温，远远超过癌症细胞坏死所需的温度（42℃）。在水组中几乎没有温度升高，这表明808nm的水的光的吸收是最小的，因此引起最小的组织损伤。bt6 np的光热转换效率（pce，η）进一步确定为36%（图s20，支持信息），验证了良好的光热效应。表s4总结了bt3和bt6单体及其np的关键光物理参数（支持信息）。利用飞秒瞬态（fs-ta）光谱测量方法研究了bt6的激发态动力学。bt6分子在thf中在580-620nm处的动力学曲线显示，在13.9ps处有一个衰变组分（图s21和表s5，支持信息）。这种相对短寿命的衰变分量与报道的非辐射衰变寿命相匹配。还研究了水中bt6 np的fs-ta光谱（图s22，支持信息）。聚集bt6分子后产生新的成分。其中，超快的两种衰变（0.08ps和3.02ps）是非辐射衰变成分，属于光热效应。75.5ps的相对长寿命组分是1o2生成的荧光通道和三重态激发态，这在游离bt6分子中是不存在的。因此，分子的聚集产生了具有长寿命的新通道，用于产生nir-ii荧光和1o2。
此外，通过记录加热/冷却循环，研究了bt6 np的光热稳定性。如图s23（支持信息）所示，在5个辐照周期后，bt6 np的温度仅略有下降，而在相同条件下，icg的温度衰减严重。在一个月的储存期内，bt6 np的吸光度变化可以忽略不计，这也证明了长期储存的稳定性（图s24，支持信息）。许多报道的j聚集体仅在室温下的特定溶剂环境中具有稳定性，并且可能在包括蛋白质在内的生理溶液中由于分子间相互作用或高温而被破坏。因此，进一步研究了bt6 np在dulbecco改良eagle培养基（dmem）和人血清白蛋白（hsa）混合物中的稳定性。如图s25（支持信息）所示，即使在37℃下孵育48小时，bt6 np在dmem/hsa混合物中的吸收也仅略有下降，证明了稳定的j型聚集。因此，这些结果表明，bt6-np是一种优越的光疗剂，可用于进一步的体外试验。
图4. bt6纳米颗粒的体外光疗性能。a） 不同条件下4t1细胞中ros生成的共聚焦荧光图像。探针：dcfh-da用于ros染色，hoechst 33342用于细胞核染色。比例尺：50μm。b） 不同处理后用钙黄绿素am和同二聚乙锭-1染色的a549细胞的共聚焦荧光图像。比例尺：100μm。c） 4t1和d）a549细胞在808nm激光（1w cm-2）处理9分钟（n=4）下的bt6 np浓度依赖性生存能力。数据以平均值±标准差表示。
2.4 体外活性氧评价与抗癌性能
使用2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（dcfh-da）作为ros探针检测细胞内ros的产生，同时用hoechst 33342染料对细胞核进行染色。如图4a和图s26（支持信息）所示，仅pbs组、pbs+激光组和仅bt6 nps组的4t1癌症细胞没有显示ros氧化的2'，7'-二氯荧光素（dcf）的绿色荧光信号，表明细胞内没有ros生成。相比之下，激光照射组的bt6 np中的4t1细胞显示出随着照射时间的推移逐渐增加的绿色荧光。bt6 np的细胞内ros生成能力也在a549和hela细胞中进行了评估，显示出与4t1细胞系相同的结果（图s27和s28，支持信息）。这些结果表明，bt6np在激光照射下可以进入多种癌症细胞并有效地产生活性氧。通过活/死细胞染色进一步研究bt6 nps的抗癌性能，其中绿色钙黄绿素am染色活细胞的细胞质，而红色乙炔同二聚体-1染色死细胞的细胞核。如图4b所示，仅pbs组、pbs+激光组和仅bt6 nps组的细胞质内观察到亮绿色荧光，表明这些组没有抗癌作用。相比之下，bt6 nps+激光组的细胞核内观察到亮红色荧光，说明其具有优异的光动力和光热抗癌性能。还使用4t1和a549癌症细胞系进行了标准mtt检测，以证明bt6 nps的细胞杀伤性能。如图4c所示，当在808nm激光照射下与50μg ml-1的bt6 np孵育时，4t1细胞显示出显著降低的生存能力，降至约6%。相反，在仅bt6 np组中，4t1细胞活力仅显示出轻微下降至87%。同样，bt6 nps+激光组a549癌症细胞的存活率也较低，而仅nps组保持良好的细胞存活率（图4d）。这些结果表明，bt6纳米粒可用于不同癌症细胞的近红外光激活光疗，具有低暗毒性，可用于生物医学应用。
2.5 体内nir-ii荧光成像
图5. 血管和肿瘤的体内nir-ii荧光成像。a） 使用bt6 np进行全身血管成像，bt6 np具有不同的高通滤波器和相应的半zui da全宽分析。激发源：793nm激光。比例尺：20mm。b）体内nir-ii荧光图像和c）静脉注射bt6 np后4t1荷瘤小鼠在0、3、6、12、24、36、48、72、，和96小时。d）离体nir-ii荧光图像和e）在注射bt6 np后36小时从4t1荷瘤小鼠切除的不同器官和肿瘤的相应荧光强度（n＝3）。激发源：808nm激光。数据以平均值±标准差表示。
由于bt6 np具有优异的nir-ii发射，因此使用ingaas探测器进行全身血管成像以评估大深度成像性能。如图5a所示，注射bt6 np后，小鼠的血管可以被识别。值得注意的是，与使用900nm lp滤波器拍摄的成像图像相比，使用1300nm和1100nm lp滤波器的成像图像显示出显著改善的对比度和明显减少的背景干扰。同时，绘制血管的nir ii荧光强度以展示横截面强度分布。很明显，半峰全宽（fwhm）从使用900nm lp滤波器的0.49mm减小到使用1300nm lp滤光片的0.38mm，验证了通过使用更长波长成像增强的成像分辨率。
nir-ii荧光成像也可用于指导体内光疗，以优化治疗效果。如图5b所示，在注射bt6 np后的不同时间点收集4t1荷瘤裸鼠的体内nir-ii荧光图像。肿瘤部位的荧光强度随着时间的推移而增强，并在注射后36小时达到zui da值，这可以作为zui jia光疗传导时间点（图5c）。此外，在注射后36小时从小鼠身上切除主要器官和肿瘤组织，以进行离体荧光成像。如图5d和e所示，nir-ii荧光信号主要分布在肝脏和肿瘤组织中，表明bt6 np可以在肿瘤部位积累。
2.6 体内光疗疗效
良好的体外实验结果鼓励我们通过使用bt6 np进一步进行体内光疗。通过使用静脉注射bt6 np的4t1荷瘤裸鼠，然后在注射后36小时进行808nm激光激发，来研究体内光治疗性能。使用红外热成像相机记录bt6 np肿瘤部位的光致发热。如图6a和图b所示，在5分钟808nm光照射下，仅pbs组的温度仅略有升高3.4°c。相反，在相同的处理条件下，bt6 np组可以观察到温度迅速升高到50°c左右，这对于光热处理来说足够高。如图6c、d和图s29（支持信息）所示，由于光诱导的ros和bt6 np的发热，bt6 nps+激光组显示出显著的肿瘤去除效果。与pbs对照组相比，pbs+激光和仅bt6 np组中的小鼠肿瘤显示出相似的大小，这意味着仅激光治疗或仅注射np不能提供抗肿瘤效果。还通过测量从治疗开始的肿瘤体积来记录整个治疗期。如图6e所示，bt6 nps+激光组小鼠的肿瘤生长在前两天的光疗治疗后得到有效抑制，在接下来的12天内没有明显的复发。然而，pbs、pbs+激光和仅bt6 np组中的肿瘤在整个两周的治疗期间显示出持续生长。此外，每2天记录不同组小鼠的体重，以研究治疗的体内毒性。不同组的所有小鼠体重相似，在治疗过程中略有增加，这在一定程度上意味着bt6 np的生物安全性（图6f）。
图6. bt6 np对4t1荷瘤小鼠的体内光疗性能。a） 红外热图像和b）在注射pbs或bt6 np后36小时，用808nm激光照射不同时间的4t1荷瘤小鼠的相应温度分布。激发源：808nm激光，1 w cm-2。c） 小鼠和d）不同治疗组在第14天的肿瘤图像。e） 不同治疗组14天的肿瘤生长曲线（n=5）。f） 治疗期间不同治疗组的小鼠体重（n=5）。g） h&e和tunel染色。比例尺：200μm。数据以平均值±标准差表示。p值通过使用tukey检验的单因素方差分析计算，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.00
为了进一步研究治疗的疗效和生物相容性，系统地进行了组织学染色和血液分析。如图6g所示，bt6 nps+激光组的肿瘤组织苏木精和伊红（h&e）染色显示，肿瘤细胞严重破坏，坏死明显，这在其他组中没有发现。末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记（tunel）结果进一步说明了bt6 nps+激光组中癌症细胞的明显凋亡，这在其他组中没有观察到。这些结果证实了808nm激光照射的bt6 np可导致严重的肿瘤细胞死亡。此外，还对用各种制剂处理的小鼠的各种器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行h&e染色。如图s30（支持信息）所示，特定器官的所有染色组都显示出相似的结果，反映出没有明显的器官损伤。最后，从四组小鼠中采集血液，进行血液生物化学和完整的血型分析。如图s31（支持信息）所示，bt6 nps+激光组的所有测量参数与其他组相比均无显著差异，表明肝毒性和肾毒性可忽略不计。此外，两组的完整血液参数也显示出相似的结果，进一步验证了bt6 np的体内生物安全性（图s32，支持信息）。
3.结论
总之，我们开发了一种新型的nir-ii放射j聚集纳米粒子（bt6 np），具有抗猝灭财产，用于高效的体内生物成像和癌症光热研究。分子设计策略可以同时实现大的斯托克斯位移和aie效应。这两个特征有效地解决了先前报道的nir-ii j聚集体的猝灭问题，并在bt6 np中提供超过1050nm的明亮发射和402nm的大斯托克斯位移。此外，bt6np还可以在808nm激光照射下产生ros和热量，用于癌症光疗。体内实验全面证明bt6 nps是nir-ii荧光成像和成像引导癌症光疗的优秀试剂。因此，本研究说明了具有精确调谐光物理财产的j聚集nir-ii发射器的设计范例。我们预计，这种策略将为构建用于生物成像应用的明亮nir-ii发射j聚集体铺平道路。
参考文献
lee, k. w., gao, y., wei, w. c., tan, j. h., wan, y., feng, z., et al. (2023). anti-quenching nir-ii j-aggregates of benzo[c]thiophene fluorophore for highly efficient bioimaging and phototheranostics. adv mater, e2211632.
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