小鼠膜结合HLA-E亚型(mHLA-E）ELISA试剂盒课题研究
小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）elisa试剂盒课题研究
小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）elisa试剂盒实验原理
小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）elisa试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、hrp标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（od 值），计算样品浓度。
样本处理及要求
1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：用edta或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的pbs (0.01m, ph=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9ml的pbs，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在pbs中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
需要而未提供的试剂盒器材
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
3.37℃恒温箱
4.蒸馏水或去离子水
名称
96孔配置
48孔配置
备注
微孔酶标板
8孔×12条
8孔×6条
无
标准品
0.3ml*6管
0.3ml*6管
无
样本稀释液
6ml
3ml
无
检测抗体-hrp
10ml
5ml
无
20×洗涤缓冲液
25ml
15ml
按说明书进行稀释
底物a
6ml
3ml
无
底物b
6ml
3ml
无
终止液
6ml
3ml
无
封板膜
2张
2张
无
说明书
1份
1份
无
自封袋
1个
1个
无
备注：
1、标准品浓度依次为：详见说明书；
2、经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μl样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。
注意事项
1、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2、洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3、消除板底残留的液体和手指印，否则影响od值。
4、底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6、在储存和温育时避免强光直接照射。
7、平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9、不能使用过期产品。
10、如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；
3.样本孔中加入待测样本50μl；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（hrp）标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μl），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。
实验结果计算
以所测标准品的od值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的od值代入方程，计算出样品的浓度。
试剂盒性能
1、检测范围：详见产品说明书。
2、灵敏度：最di检测浓度小于0.1u/l。
3、特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4、重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于15%。
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小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）elisa试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、hrp标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠膜结合hla-e亚型(mhla-e）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（od 值），计算样品浓度。
样本处理及要求
1. 血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：用edta或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 组织匀浆：用预冷的pbs (0.01m, ph=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的pbs（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9ml的pbs，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在pbs中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4. 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
需要而未提供的试剂盒器材
1.酶标仪（450nm）
2.高精度加样器及枪头：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
3.37℃恒温箱
4.蒸馏水或去离子水
名称
96孔配置
48孔配置
备注
微孔酶标板
8孔×12条
8孔×6条
无
标准品
0.3ml*6管
0.3ml*6管
无
样本稀释液
6ml
3ml
无
检测抗体-hrp
10ml
5ml
无
20×洗涤缓冲液
25ml
15ml
按说明书进行稀释
底物a
6ml
3ml
无
底物b
6ml
3ml
无
终止液
6ml
3ml
无
封板膜
2张
2张
无
说明书
1份
1份
无
自封袋
1个
1个
无
备注：
1、标准品浓度依次为：详见说明书；
2、经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μl样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。
注意事项
1、严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2、洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3、消除板底残留的液体和手指印，否则影响od值。
4、底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
5、避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6、在储存和温育时避免强光直接照射。
7、平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8、任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9、不能使用过期产品。
10、如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。
试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；
3.样本孔中加入待测样本50μl；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（hrp）标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μl），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。
实验结果计算
以所测标准品的od值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的od值代入方程，计算出样品的浓度。
试剂盒性能
1、检测范围：详见产品说明书。
2、灵敏度：最di检测浓度小于0.1u/l。
3、特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4、重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于15%。
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