【热点应用】加速生物药物的早期研发：突变体筛选
加速生物药物的早期研发：突变体筛选
差示扫描荧光法 （dsf，内在荧光法）是一种经济高效且易于使用的非标记生物物理技术，其原理是通过测量温度升高时荧光发射的相应变化来确定蛋白质的热变性转变温度（所谓的熔解温度，tm值）。
新一代高通量差示扫描荧光仪 supr-dsf 利用内在荧光 (if)技术，依赖于色氨酸固有荧光发射光谱波长的变化。supr-dsf 使用行业标准的 384 微孔板，在几小时内，而不是几天和几周，就可以对数千个样品的稳定性进行测量和比较。supr-dsf 结合了低样品用量和高通量两个优势，解决了传统技术所遇到的挑战。
图2内在荧光 dsf 原理：依赖于色氨酸固有荧光发射光谱的变化
01
测试方法实例
在生物药物早期发现中可以使用 supr-dsf 进行突变体的比较和筛选，本例对 16 个样品进行比较，其中包括 1 个野生型蛋白（wt）和 15 个单点突变体。
准备终浓度为 0.2 mg/ml的样品，以每孔 20 μl 的体积将其加入384微孔板，每个样品做三次重复，在微孔板上放置透光膜以防止蒸发。微孔板以 1°c/min 的速率进行扫描，扫描温度范围为 20°c - 100°c。使用标准方程对数据进行拟合，然后通过熔解温度 tm 对稳定性进行排序。
02
测试结果
supr-dsf 生成了16个样品的高质量熔解曲线，并且，计算出的三次重复数据的熔解温度差异小于 0.2°c。如图3所示，与野生型wt（蓝色）相比，其中3个突变体（9、13和14）的熔解曲线左移，说明其蛋白稳定性降低；其余12个突变体的稳定性均有所提高，突变体1、8和12的稳定性提高最大。
图3 15个突变体（橙色）与野生型（蓝色）的熔解曲线对比
图4展示了几个代表性样品的熔解曲线，可以发现一些蛋白质发生了单一热转变（wt蛋白与突变体7和8），而另一些蛋白质（突变体1和14）则清楚地显示出两次热转变，熔解曲线上有两个拐点。此外，包括突变体1在内的几个突变体在第一次热转变时具有与突变体8非常相似的熔解曲线，但随后在更高的温度下进行了第二次热转变。
突变蛋白质从单一热转变到两次热转变的变性能力表明，进一步的修饰应该关注于蛋白质中较不稳定的区域。通过 supr-dsf 提供的数据，可以帮助研究者筛选出有前景的候选物进行深入研究。
图4 代表性样品的熔解曲线
上述实验中supr-dsf在1.5小时内产生了48个样品（16个突变体，3次重复）的高质量熔解曲线，但很容易扩展到384个样品（一块384孔板），在同样的扫描条件下完成384个样品的测试也仅需1.5小时。
结论 conclusion
通过上述实验可以看出supr-dsf与目前稳定性研究的其他技术相比，具有非常显著的高通量优势。supr-dsf不仅记录了熔解温度 tm，还可以给出：去折叠的起始温度 tonset和范特霍夫焓变δhvh，从而更深入地了解样品之间的差异。
综上所述，新一代 supr-dsf具有高灵敏度、高通量和耗材通用性好等优势，使用10-20 μl样品在90分钟内即可给出384个样品的tm、tonset和δhvh等信息，确定不同样品之间的微小差异，避免候选药物的下游失败，从而大大节省了生物治疗药物发现过程中的时间和成本。
参考文献
[1] walters j, milam sl and clark ac. practical approachesto protein folding and assembly: spectroscopic strategies in thermodynamics andkinetics. methods in enzymology. 2009, 445: 1-39.
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图2内在荧光 dsf 原理：依赖于色氨酸固有荧光发射光谱的变化
01
测试方法实例
在生物药物早期发现中可以使用 supr-dsf 进行突变体的比较和筛选，本例对 16 个样品进行比较，其中包括 1 个野生型蛋白（wt）和 15 个单点突变体。
准备终浓度为 0.2 mg/ml的样品，以每孔 20 μl 的体积将其加入384微孔板，每个样品做三次重复，在微孔板上放置透光膜以防止蒸发。微孔板以 1°c/min 的速率进行扫描，扫描温度范围为 20°c - 100°c。使用标准方程对数据进行拟合，然后通过熔解温度 tm 对稳定性进行排序。
02
测试结果
supr-dsf 生成了16个样品的高质量熔解曲线，并且，计算出的三次重复数据的熔解温度差异小于 0.2°c。如图3所示，与野生型wt（蓝色）相比，其中3个突变体（9、13和14）的熔解曲线左移，说明其蛋白稳定性降低；其余12个突变体的稳定性均有所提高，突变体1、8和12的稳定性提高最大。
图3 15个突变体（橙色）与野生型（蓝色）的熔解曲线对比
图4展示了几个代表性样品的熔解曲线，可以发现一些蛋白质发生了单一热转变（wt蛋白与突变体7和8），而另一些蛋白质（突变体1和14）则清楚地显示出两次热转变，熔解曲线上有两个拐点。此外，包括突变体1在内的几个突变体在第一次热转变时具有与突变体8非常相似的熔解曲线，但随后在更高的温度下进行了第二次热转变。
突变蛋白质从单一热转变到两次热转变的变性能力表明，进一步的修饰应该关注于蛋白质中较不稳定的区域。通过 supr-dsf 提供的数据，可以帮助研究者筛选出有前景的候选物进行深入研究。
图4 代表性样品的熔解曲线
上述实验中supr-dsf在1.5小时内产生了48个样品（16个突变体，3次重复）的高质量熔解曲线，但很容易扩展到384个样品（一块384孔板），在同样的扫描条件下完成384个样品的测试也仅需1.5小时。
结论 conclusion
通过上述实验可以看出supr-dsf与目前稳定性研究的其他技术相比，具有非常显著的高通量优势。supr-dsf不仅记录了熔解温度 tm，还可以给出：去折叠的起始温度 tonset和范特霍夫焓变δhvh，从而更深入地了解样品之间的差异。
综上所述，新一代 supr-dsf具有高灵敏度、高通量和耗材通用性好等优势，使用10-20 μl样品在90分钟内即可给出384个样品的tm、tonset和δhvh等信息，确定不同样品之间的微小差异，避免候选药物的下游失败，从而大大节省了生物治疗药物发现过程中的时间和成本。
参考文献
[1] walters j, milam sl and clark ac. practical approachesto protein folding and assembly: spectroscopic strategies in thermodynamics andkinetics. methods in enzymology. 2009, 445: 1-39.
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