细胞胱硫醚-γ-裂解酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
细胞胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；cgl）活性光度法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
细胞胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；cgl）活性光度法定量检测试剂是一种旨在运用胱硫醚作为底物，在裂解酶的催化下，产生半，使用ellman试剂后，呈现黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液或纯化酶样品胱硫醚-γ-裂解的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；cgl；ec4.4.1.1），又称为胱硫醚酶（cystathionase），是转硫化（transsulfuration）通路中的关键酶之一。在细菌、真菌和植物中，为正向（forward）转硫化，而在哺乳动物、真菌和某些细菌为逆向（reverse）转硫化，构成含硫氨基酸半（cysteine）和蛋氨酸（methionine）的相互转换，调节高半浓度和半合成，并参与合成。胱硫醚-γ-裂解酶为辅基5-磷酸吡哆醛（pyridoxal-5-phosphate；plp）依赖性酶，催化胱硫醚（cystathionine）降解为半、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨；并具有催化高（homoserine）消去反应（elimination reaction），产生2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）、氨和水；催化（cystine）消去反应，产生硫化半（thiocysteine）丙酮酸和氨；催化半的消去反应，产生丙酮酸、硫化氢和氨。胱硫醚-γ-裂解酶参与硫化氢代谢通路（第三种气体性传导介质gasotransmitter）调节，与血管松弛、炎性反应、凋亡、缺血再灌注、氧化应激等有关。人体胱硫醚-γ-裂解酶异常，会导致胱硫醚尿症（cystathioninuria）、病（cystinosis）、恶性淋巴细胞病变等疾病，对于酒精性肝损伤敏感。基于底物胱硫醚，在胱硫醚-γ-裂解酶的催化下，产生半、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨，进而半侧链巯基与ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；dtnb]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；tnb），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析胱硫醚-γ-裂解酶的活性。胱硫醚-γ-裂解酶反应系统为：
产品内容
清理液（reagent a） 毫升
裂解液（reagent b） 毫升
缓冲液（reagent c） 毫升
反应液（reagent d） 微升
底物液（reagent e） 毫升
阴性液（reagent f） 微升
显色液（reagent g） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液（reagent b）、反应液（reagent d）、底物液（reagent e）和显色液（reagent g）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；显色液（reagent g）避免光照；有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞
（微型）台式离心机：用于样品制备
200微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析
实验步骤
一、样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（reagent a），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用消化）
5．加入xx毫升清理液（reagent a），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（reagent b），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
16．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，并置零
2．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（reagent d）、底物液（reagent e）和显色液（reagent g）避免光照
3．缓冲液（reagent c）室温下均衡温度
三、样品背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升底物液（reagent e）
3．加入xx微升阴性液（reagent f）
4．加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在37℃温度下孵育30分钟
7．加入xx微升显色液（reagent g），混匀
8．在37℃温度下孵育5分钟
9．即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照
四、样品活性测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．加入xx微升底物液（reagent e）
4．加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在37℃温度下孵育30分钟
7．加入xx微升显色液（reagent g），混匀
8．在37℃温度下孵育5分钟
9．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数
五、计算样品活性
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：样品背景对照和样品活性
2．分别移取xx微升缓冲液（reagent c）到96孔板的所有孔里
3．加入xx微升阴性液（reagent e）到样品背景对照孔里
4．加入xx微升反应液（reagent d）到样品活性孔里
5．分别加入xx微升底物液（reagent e）到所有孔里
6．分别加入20微升待测样品（100微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈）
7．轻轻摇动96孔板
8．在37℃温度下孵育30分钟
9．分别加入xx微升显色液（reagent g）到所有孔里
10．轻轻摇动96孔板
11．在37℃温度下孵育5分钟
12．即刻放进酶标仪检测：获得背景和样品活性读数
13．活性计算：
注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品须澄清，至关重要
5．测定值由低到高变化
6．光度测定后，比色皿须清洗
7．反应时间持续30分钟
8．建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供 bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
9．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
10．可以使用胱硫醚-γ-裂解酶抑制剂dl-炔丙基（dl-propargylglycine）作为抑制剂对照或阴性对照
11．胱硫醚-γ-裂解酶单位活性定义为：在37℃，ph 8.2条件下，每分钟内产生1微摩尔半所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列转硫化（transsulfuration）通路分析试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
关键词：台式离心机 酶标仪 离心机
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清理液（reagent a） 毫升
裂解液（reagent b） 毫升
缓冲液（reagent c） 毫升
反应液（reagent d） 微升
底物液（reagent e） 毫升
阴性液（reagent f） 微升
显色液（reagent g） 微升
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一、样品准备
1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 x 106细胞）
2．小心加入xx毫升清理液（reagent a），覆盖生长表面
3．小心抽去清理液
4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用消化）
5．加入xx毫升清理液（reagent a），混匀细胞
6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8．小心抽去上清液
9．加入xx微升裂解液（reagent b），充分混匀
10．转移到预冷的1.5毫升离心管
11．强力涡旋震荡15秒
12．置于冰槽里孵育30分钟
13．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000rpm，例如eppendorf 5415）
14．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
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1．开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，并置零
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三、样品背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升底物液（reagent e）
3．加入xx微升阴性液（reagent f）
4．加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在37℃温度下孵育30分钟
7．加入xx微升显色液（reagent g），混匀
8．在37℃温度下孵育5分钟
9．即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照
四、样品活性测定
1．移取xx微升缓冲液（reagent c）到新的比色皿
2．加入xx微升反应液（reagent d）
3．加入xx微升底物液（reagent e）
4．加入20微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
5．上下倾倒数次，混匀
6．在37℃温度下孵育30分钟
7．加入xx微升显色液（reagent g），混匀
8．在37℃温度下孵育5分钟
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五、计算样品活性
六、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：样品背景对照和样品活性
2．分别移取xx微升缓冲液（reagent c）到96孔板的所有孔里
3．加入xx微升阴性液（reagent e）到样品背景对照孔里
4．加入xx微升反应液（reagent d）到样品活性孔里
5．分别加入xx微升底物液（reagent e）到所有孔里
6．分别加入20微升待测样品（100微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈）
7．轻轻摇动96孔板
8．在37℃温度下孵育30分钟
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10．轻轻摇动96孔板
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13．活性计算：
注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品须澄清，至关重要
5．测定值由低到高变化
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7．反应时间持续30分钟
8．建议待测样本蛋白浓度为100微克/20微升（本公司提供 bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
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10．可以使用胱硫醚-γ-裂解酶抑制剂dl-炔丙基（dl-propargylglycine）作为抑制剂对照或阴性对照
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质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感
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