水产品中大环内酯类药物残留量的测定GB 31660.1-2019
中华人民共和国国家标准
gb 31660.1-2019
食品安全国家标准
水产品中大环内酯类药物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
前言
本标准按照gb/t 1. 1-2009给出的规则起草。
本标准系首ci发布。
1范围
本标准规定了水产品中竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素9种大环内酯类药物残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于水产品中鱼、虾、蟹、贝类等的可食组织中竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌9种大环内酯类药物残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不ke少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
试样中大环内酯类药物的残留经乙腈提取，正己烷除脂、中性氧化铝柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
4试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t6682规定的一级水。
4.1试剂
4.1.1乙腈（ch3cn）：色谱纯。
4.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。
4.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯。
4.1.4甲酸（hcooh）：色谱纯
4.1.5乙酸铵（ch3coonh4）。
4.1.6异丙醇[（ch3）2choh]。
4.2溶液配制
4.2.1乙腈饱和正己烷：取正己烷200 ml于250 ml分液漏斗中加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层即得。
4.2.2 0.05mol/l乙酸铵溶液；取乙酸铵0.77 g，用水溶解并稀释至200 ml。
4.2.3 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 ml，用水溶解并稀释至1000 ml。
4.2.4定容液：取乙腈20 ml和乙酸铵溶液80 ml，混合均匀。
4.3标准品
竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素含量≥92.0%，吉他霉素≥72.0%，具体内容参见附录a。
4.4标准溶液制备
4.4.1标准储备液：取竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素标准品各适量（相当于各活性成分10mg），精密称定，分别于100ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100μg/ml大环内酯类药物标准储备液。红霉素、克拉霉素和泰乐菌素-20℃以下避光保存，竹桃霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星4℃以下避光保存，有效期3个月。
4.4.2混合标准工作液：精密量取标准储备液各1ml，于10ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml大环内酯类药物混合标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。
4.5材料
4.5. 1中性氧化铝固相萃取柱：2g/6ml，或相当者。
4.5.2尼龙微孔滤膜：0. 22μm。
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
5.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
5.3氮吹仪。
5.4涡旋振荡器：3000r/min。
5.5移液枪：200μl，1ml，5ml。
5.6离心机：4000r/min。
5.7梨形瓶：100ml。
5.8超声波振荡器。
5.9旋转蒸发器。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质：
a）取均质后的供试样品，作为供试试料；
b）取均质后的空白样品，作为空白试料；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。
7测定步骤
7.1提取
取试料5g（准确至±20mg），于50ml塑料离心管中加入乙腈20 ml，于涡旋振荡器上以2000r/min涡旋1min，超声5min，以3500r/min离心6min，取上清液转移至另一离心管中，残渣再加乙腈15 ml，重复提取一次，合并上清液，备用。
7.2净化
中性氧化铝固相萃取柱预先用乙腈5ml活化，取备用液过柱，用乙腈5ml洗脱，收集洗脱液于梨形瓶中，加入异丙醇4ml，40℃旋转蒸发至干。精密加入定容液2ml溶解残余物，加乙腈饱和正己烷2ml，转至10ml离心管中，涡旋10s，以3000r/min离心8min，取下层清液过0. 22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。
7.3基质匹配标准曲线的制备
精密量取混合标准工作液适量，用空白样品提取液溶解稀释，配制成大环内酯类药物浓度为1ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、100ngml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml的系列基质标准工作溶液；现配现用。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.4测定
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱（150mm×2.0mm，5μm）或相当者；
b）流动相：a为0.1%的甲酸水溶液，b为乙腈，梯度洗脱条件见表1；
c）流速：0.2ml/min；
d）柱温：30℃；
e）进样量：10μl。
7.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾（esi）离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测；
d）喷雾电压：4000v；
e）离子传输毛细管温度：350℃；
f）雾化气压力：248kpa；
g）辅助气压力：48kpa；
h）定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表2。
7.4.3测定法
7.4.3.1定性测定
在同样测试条件下，试样溶液中大环内酯类药物的保留时间与标准工作液中大环内酯类药物的保留时间之比，偏差在±5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。
7.4.3.2定量测定
按7.4.1和7.4.2设定仪器条件以基质标准干作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，作单点或多点校准，按外标法计算试样中药物的残留量，定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片。标准溶液特征离子质量色谱图参见阳录b。
7.5空白试验
除不加试料外，均按上述测定步骤进行。
8结果计算和表述
试样中待侧药物的残留量按式（1）计算。
式中：
x——试样中被测组分的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——标准工作液测得的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
a——试样溶波中被测组分峰面积；
as——标准工作液被测组分峰面积；
v——试样容液定容体积，单位为毫开（ml）；
m——试科质量：单位为克（g）
计算结果需扣除空白值，测定结果用2次平行测定的算术平均值表示保留3位有效数字。
9方法灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度
本方法的检测限为1.0μg/kg；红霉聚、替米考星定量限为2.0μg/kg，竹桃霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、泰乐菌素定量限为4.0μg/kg。
9.2准确度
红霉素、替米考星在2.0μg/kg~40μg/kg添加浓度的回收率为70%~120%；竹桃霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、泰乐菌素在4.0μg/kg~40μg/kg添加浓度的回收率为70%~120%。
9.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
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前言
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1范围
本标准规定了水产品中竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素9种大环内酯类药物残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本标准适用于水产品中鱼、虾、蟹、贝类等的可食组织中竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌9种大环内酯类药物残留量的检测。
2规范性引用文件
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3原理
试样中大环内酯类药物的残留经乙腈提取，正己烷除脂、中性氧化铝柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
4试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t6682规定的一级水。
4.1试剂
4.1.1乙腈（ch3cn）：色谱纯。
4.1.2甲醇（ch3oh）：色谱纯。
4.1.3正己烷（c6h14）：色谱纯。
4.1.4甲酸（hcooh）：色谱纯
4.1.5乙酸铵（ch3coonh4）。
4.1.6异丙醇[（ch3）2choh]。
4.2溶液配制
4.2.1乙腈饱和正己烷：取正己烷200 ml于250 ml分液漏斗中加入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层即得。
4.2.2 0.05mol/l乙酸铵溶液；取乙酸铵0.77 g，用水溶解并稀释至200 ml。
4.2.3 0.1%甲酸溶液：取甲酸1 ml，用水溶解并稀释至1000 ml。
4.2.4定容液：取乙腈20 ml和乙酸铵溶液80 ml，混合均匀。
4.3标准品
竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素含量≥92.0%，吉他霉素≥72.0%，具体内容参见附录a。
4.4标准溶液制备
4.4.1标准储备液：取竹桃霉素、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星和泰乐菌素标准品各适量（相当于各活性成分10mg），精密称定，分别于100ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为100μg/ml大环内酯类药物标准储备液。红霉素、克拉霉素和泰乐菌素-20℃以下避光保存，竹桃霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、替米考星4℃以下避光保存，有效期3个月。
4.4.2混合标准工作液：精密量取标准储备液各1ml，于10ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml大环内酯类药物混合标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。
4.5材料
4.5. 1中性氧化铝固相萃取柱：2g/6ml，或相当者。
4.5.2尼龙微孔滤膜：0. 22μm。
5仪器和设备
5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
5.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
5.3氮吹仪。
5.4涡旋振荡器：3000r/min。
5.5移液枪：200μl，1ml，5ml。
5.6离心机：4000r/min。
5.7梨形瓶：100ml。
5.8超声波振荡器。
5.9旋转蒸发器。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质：
a）取均质后的供试样品，作为供试试料；
b）取均质后的空白样品，作为空白试料；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。
6.2试料的保存
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7测定步骤
7.1提取
取试料5g（准确至±20mg），于50ml塑料离心管中加入乙腈20 ml，于涡旋振荡器上以2000r/min涡旋1min，超声5min，以3500r/min离心6min，取上清液转移至另一离心管中，残渣再加乙腈15 ml，重复提取一次，合并上清液，备用。
7.2净化
中性氧化铝固相萃取柱预先用乙腈5ml活化，取备用液过柱，用乙腈5ml洗脱，收集洗脱液于梨形瓶中，加入异丙醇4ml，40℃旋转蒸发至干。精密加入定容液2ml溶解残余物，加乙腈饱和正己烷2ml，转至10ml离心管中，涡旋10s，以3000r/min离心8min，取下层清液过0. 22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。
7.3基质匹配标准曲线的制备
精密量取混合标准工作液适量，用空白样品提取液溶解稀释，配制成大环内酯类药物浓度为1ng/ml、5ng/ml、20ng/ml、100ngml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml的系列基质标准工作溶液；现配现用。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
7.4测定
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：c18色谱柱（150mm×2.0mm，5μm）或相当者；
b）流动相：a为0.1%的甲酸水溶液，b为乙腈，梯度洗脱条件见表1；
c）流速：0.2ml/min；
d）柱温：30℃；
e）进样量：10μl。
7.4.2质谱参考条件
a）离子源：电喷雾（esi）离子源；
b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测；
d）喷雾电压：4000v；
e）离子传输毛细管温度：350℃；
f）雾化气压力：248kpa；
g）辅助气压力：48kpa；
h）定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表2。
7.4.3测定法
7.4.3.1定性测定
在同样测试条件下，试样溶液中大环内酯类药物的保留时间与标准工作液中大环内酯类药物的保留时间之比，偏差在±5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。
7.4.3.2定量测定
按7.4.1和7.4.2设定仪器条件以基质标准干作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，作单点或多点校准，按外标法计算试样中药物的残留量，定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片。标准溶液特征离子质量色谱图参见阳录b。
7.5空白试验
除不加试料外，均按上述测定步骤进行。
8结果计算和表述
试样中待侧药物的残留量按式（1）计算。
式中：
x——试样中被测组分的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
cs——标准工作液测得的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
a——试样溶波中被测组分峰面积；
as——标准工作液被测组分峰面积；
v——试样容液定容体积，单位为毫开（ml）；
m——试科质量：单位为克（g）
计算结果需扣除空白值，测定结果用2次平行测定的算术平均值表示保留3位有效数字。
9方法灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度
本方法的检测限为1.0μg/kg；红霉聚、替米考星定量限为2.0μg/kg，竹桃霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、泰乐菌素定量限为4.0μg/kg。
9.2准确度
红霉素、替米考星在2.0μg/kg~40μg/kg添加浓度的回收率为70%~120%；竹桃霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素、交沙霉素、螺旋霉素、泰乐菌素在4.0μg/kg~40μg/kg添加浓度的回收率为70%~120%。
9.3精密度
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