Percoll细胞分离液的使用方法
实验原理
percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20mosm／kg h２o)，粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
实验试剂
1. 小牛血清
2. percoll细胞分离液
3. 8.5％nacl
4. 1.5mpbs
实验设备
1. 高速冷冻离心机(3k-30)
2. 4℃、-20℃冰箱
3. 长针头注射器
4. 1.5ml和10ml离心管
实验材料
pbmc细胞
实验步骤
1. 不同浓度(密度)percoll溶液的制备: 先用9份percoll与1份8.5％ nacl或1.5m pbs混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ nacl或0.15m pbs)稀释到所需浓度。
2. 不连续密度梯度percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层percoll比重相差不大时，可将percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
3. 装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
4. 离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
5. 取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于percoll层中，则需要逐层收集。收获含有percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
举例：
1. 富含nk活性大颗粒淋巴细胞(lgl)的纯化：按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的percoll，如用10ml试管(或塑料管)分离，每层percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的pbmc细胞1×108悬于1ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含nk杀伤活性的lgl细胞位于42.5％与45％percoll界面以及上下二层的percoll液中。
2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％percoll液。收取经pha(或其它抗原、有丝分裂原)刺激pbmc，或含有较高比例异型的pbmc(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
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实验试剂
1. 小牛血清
2. percoll细胞分离液
3. 8.5％nacl
4. 1.5mpbs
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1. 高速冷冻离心机(3k-30)
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3. 长针头注射器
4. 1.5ml和10ml离心管
实验材料
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实验步骤
1. 不同浓度(密度)percoll溶液的制备: 先用9份percoll与1份8.5％ nacl或1.5m pbs混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液(0.85％ nacl或0.15m pbs)稀释到所需浓度。
2. 不连续密度梯度percoll层的制备: 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层percoll比重相差不大时，可将percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
3. 装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
4. 离心：一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
5. 取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于percoll层中，则需要逐层收集。收获含有percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
举例：
1. 富含nk活性大颗粒淋巴细胞(lgl)的纯化：按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的percoll，如用10ml试管(或塑料管)分离，每层percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的pbmc细胞1×108悬于1ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含nk杀伤活性的lgl细胞位于42.5％与45％percoll界面以及上下二层的percoll液中。
2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞：分别叠加50％和30％percoll液。收取经pha(或其它抗原、有丝分裂原)刺激pbmc，或含有较高比例异型的pbmc(如肾综合征出血热患者)，按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
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