本期分子小课堂 | 常规PCR技术介绍
pcr技术的前世今生
科学家对核酸的研究已有100多年历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的分离技术。khorana等于1971年最早提出核酸体外扩增理念：dna变性解链后与相应引物杂交，用dna聚合酶延伸，重复该过程便可以克隆基因[1]。因为当时的技术尚未成熟，该设想一直未被证实。
直到在1985年，mullis等用大肠杆菌dna聚合酶体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功（发明人kary banks mulis也因此荣获了后期的诺贝尔化学奖）。1988年saiki等将耐热dna聚合酶（taq酶）引入pcr技术，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现dna扩增的自动化，迅速推动了pcr的应用和普及[2]。随着技术不断改进，pcr技术已被广泛应用于医学、农学、植物病理学等研究领域。它从一种定性的分析方法发展到定量测定，也从原先只扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的dna片段。
pcr技术原理
pcr技术(polymerase chain reaction)即聚合酶链式反应，指在dna聚合酶的催化下，以母链dna为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板dna互补的子链dna的过程。反应的基本成分包括模板dna、引物、4种脱氧核苷酸(dntps)、dna聚合酶和适宜的缓冲液。
pcr技术的基本原理，类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr技术主要包含以下几个过程：
1）模板dna变性：模板dna经94℃加热一定时间后，使模板dna双链解离形成单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
2）模板dna与引物退火（复性）：模板dna经加热变性形成单链后，温度下降至55℃左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；
3）引物的延伸：dna模板—引物结合物在taq dna聚合酶作用下，在72℃左右，以dntps为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原则，合成一条新链。新合成的子链又重复循环变性——退火——延伸三个过程，以获得更多的新链。每个循环需要2-4min，2-3h就能将待扩增的目的基因扩增放大几百倍。
注：图片来源于网络，如有侵权请联系删除
pcr的种类
到目前为止，pcr技术发展出十几种之多，本次小爱给大家科普下几种常用的pcr。
1、普通pcr
就是我们实验室常用的pcr，技术原理如上所述。普通pcr技术是分子生物实验的基础，可以用于基因的分离、克隆和核酸序列分析等基础性研究，定性判断核酸含量；同时用于疾病的诊断或任何与dna、rna相关的检测应用。下面以一个实验为例介绍普通pcr的常规操作步骤：
实验所需试剂及耗材设备：
模板dna、引物、taq dna聚合酶(5u/ul)、包含15mmol/l mg2+的buffer、ddh2o、pcr仪、移液枪、pcr板、吸头
实验步骤：
1）配置pcr反应体系：
在pcr反应板中依次加入下列溶液：
模板dna 2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntps 1.5ul；tag酶0.5ul；ddh2o 使总体系达到20ul。
2）设置pcr反应程序：
94℃ 3min；94℃ 45s；55℃ 45s；72℃ 45s；72℃ 5min；4℃ 1h
3）上样，启动反应程序；
4）扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
爱必信拥有包含taq dna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液的pcr反应液，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。使用时只需加入dna模板和引物既可。
货号
产品名称
规格
abs60036
2×taq pcr mix
1ml×5
abs60037
2×taq pcr master mix(for page)
1ml
2、热启动pcr
热启动pcr(hot start pcr)是指它的taq dna聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的pcr，可提高反应的特异性。taq dna聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性。pcr反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在taq dna聚合酶的作用下延伸，结果会导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增，提高反应的特异性。在引物设计时如果某位点因为遗传元件的定位而受限，如site-directed突变、表达克隆或用于dna工程的遗传元件的构建和操作等情况，热启动pcr尤为有效。爱必信热启动pcr相关试剂如下：
货号
产品名称
规格
abs60032
2×hotstart taq pcr mix with loading dye
1ml
abs60033
2×hotstart taq pcr mix loading dye-free
1ml
abs60057
2×hotstart taq plus master mix（quick load）
1ml
3、高保真pcr
高保真pcr主要依赖于高保真酶。普通taq酶具有5'→3'dna聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性，缺少3'→5'的外切酶活性因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。而高保真酶具有很强的校对功能，其保真度比普通taq酶高50倍，远高于其他同类酶。因此高保真pcr特别适用于质粒构建等实验。爱必信高保真pcr相关试剂如下：
货号
产品名称
规格
abs60034
2×xerox pcr master mix
1ml
abs60055
2×pfu master mix（quick load）
1ml
abs60056
2×pfu master mix
1ml
abs44072245
pfu dna polymerase
100iu
4、长片段扩增
taq dna聚合酶在扩增长度超过4kb的pcr产物时通常会失败，原因包括非特异性引物退火、dna模板中的二级结构和次优循环条件——所有这些因素对较长的pcr产物的扩增比对较短的pcr产物有更大的影响。在长程pcr中，防止dna损失特别重要，因为模板内的单个dna损伤足以使pcr酶停滞。pcr循环过程中的dna损伤可以通过稳定反应ph的特定缓冲物质最小化。商业pcr试剂盒是专门为克服长程pcr的挑战而设计的。
货号
产品名称
规格
abs60035
2×long taq pcr master mix
1ml
abs60061
2×fast pfu master mix（quick load）
1ml
abs60062
2×fast pfu master mix
1ml
参考文献
[1] 黄留玉.pcr新技术原理,方法及应用[m].化学工业出版社,2005.
[2] 邓小红,任海芳.pcr技术详解及分析[j].重庆工商大学学报(自然科学版), 2007, 24(1):29-33.doi:10.3969/j.issn.1672-058x.2007.01.009.
[3] 粟玉刚,程天印,董欢.热启动pcr技术的研究进展[j].畜牧兽医科技信息, 2009(3):2.doi:10.3969/j.issn.1671-6027.2009.03.004.
好消息！absin文献奖励重磅升级！
absin特色产品线：
wb相关：ecl发光液、预染marker、预制胶；ihc相关：二抗试剂盒、组化笔；ip/coip试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；elisa试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
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VICKERS换向阀DG4V型的常见故障
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不锈钢油浸式潜水电泵特点与应用
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二手耙式干燥机操作过程及使用注意事项
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湿式磁选机
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科学家对核酸的研究已有100多年历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的分离技术。khorana等于1971年最早提出核酸体外扩增理念：dna变性解链后与相应引物杂交，用dna聚合酶延伸，重复该过程便可以克隆基因[1]。因为当时的技术尚未成熟，该设想一直未被证实。
直到在1985年，mullis等用大肠杆菌dna聚合酶体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功（发明人kary banks mulis也因此荣获了后期的诺贝尔化学奖）。1988年saiki等将耐热dna聚合酶（taq酶）引入pcr技术，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现dna扩增的自动化，迅速推动了pcr的应用和普及[2]。随着技术不断改进，pcr技术已被广泛应用于医学、农学、植物病理学等研究领域。它从一种定性的分析方法发展到定量测定，也从原先只扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的dna片段。
pcr技术原理
pcr技术(polymerase chain reaction)即聚合酶链式反应，指在dna聚合酶的催化下，以母链dna为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板dna互补的子链dna的过程。反应的基本成分包括模板dna、引物、4种脱氧核苷酸(dntps)、dna聚合酶和适宜的缓冲液。
pcr技术的基本原理，类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr技术主要包含以下几个过程：
1）模板dna变性：模板dna经94℃加热一定时间后，使模板dna双链解离形成单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
2）模板dna与引物退火（复性）：模板dna经加热变性形成单链后，温度下降至55℃左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；
3）引物的延伸：dna模板—引物结合物在taq dna聚合酶作用下，在72℃左右，以dntps为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原则，合成一条新链。新合成的子链又重复循环变性——退火——延伸三个过程，以获得更多的新链。每个循环需要2-4min，2-3h就能将待扩增的目的基因扩增放大几百倍。
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pcr的种类
到目前为止，pcr技术发展出十几种之多，本次小爱给大家科普下几种常用的pcr。
1、普通pcr
就是我们实验室常用的pcr，技术原理如上所述。普通pcr技术是分子生物实验的基础，可以用于基因的分离、克隆和核酸序列分析等基础性研究，定性判断核酸含量；同时用于疾病的诊断或任何与dna、rna相关的检测应用。下面以一个实验为例介绍普通pcr的常规操作步骤：
实验所需试剂及耗材设备：
模板dna、引物、taq dna聚合酶(5u/ul)、包含15mmol/l mg2+的buffer、ddh2o、pcr仪、移液枪、pcr板、吸头
实验步骤：
1）配置pcr反应体系：
在pcr反应板中依次加入下列溶液：
模板dna 2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntps 1.5ul；tag酶0.5ul；ddh2o 使总体系达到20ul。
2）设置pcr反应程序：
94℃ 3min；94℃ 45s；55℃ 45s；72℃ 45s；72℃ 5min；4℃ 1h
3）上样，启动反应程序；
4）扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
爱必信拥有包含taq dna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液的pcr反应液，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。使用时只需加入dna模板和引物既可。
货号
产品名称
规格
abs60036
2×taq pcr mix
1ml×5
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1ml
2、热启动pcr
热启动pcr(hot start pcr)是指它的taq dna聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的pcr，可提高反应的特异性。taq dna聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性。pcr反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在taq dna聚合酶的作用下延伸，结果会导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增，提高反应的特异性。在引物设计时如果某位点因为遗传元件的定位而受限，如site-directed突变、表达克隆或用于dna工程的遗传元件的构建和操作等情况，热启动pcr尤为有效。爱必信热启动pcr相关试剂如下：
货号
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1ml
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1ml
abs60057
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1ml
3、高保真pcr
高保真pcr主要依赖于高保真酶。普通taq酶具有5'→3'dna聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性，缺少3'→5'的外切酶活性因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。而高保真酶具有很强的校对功能，其保真度比普通taq酶高50倍，远高于其他同类酶。因此高保真pcr特别适用于质粒构建等实验。爱必信高保真pcr相关试剂如下：
货号
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1ml
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1ml
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100iu
4、长片段扩增
taq dna聚合酶在扩增长度超过4kb的pcr产物时通常会失败，原因包括非特异性引物退火、dna模板中的二级结构和次优循环条件——所有这些因素对较长的pcr产物的扩增比对较短的pcr产物有更大的影响。在长程pcr中，防止dna损失特别重要，因为模板内的单个dna损伤足以使pcr酶停滞。pcr循环过程中的dna损伤可以通过稳定反应ph的特定缓冲物质最小化。商业pcr试剂盒是专门为克服长程pcr的挑战而设计的。
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1ml
abs60061
2×fast pfu master mix（quick load）
1ml
abs60062
2×fast pfu master mix
1ml
参考文献
[1] 黄留玉.pcr新技术原理,方法及应用[m].化学工业出版社,2005.
[2] 邓小红,任海芳.pcr技术详解及分析[j].重庆工商大学学报(自然科学版), 2007, 24(1):29-33.doi:10.3969/j.issn.1672-058x.2007.01.009.
[3] 粟玉刚,程天印,董欢.热启动pcr技术的研究进展[j].畜牧兽医科技信息, 2009(3):2.doi:10.3969/j.issn.1671-6027.2009.03.004.
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