针法荧光定量PCR试剂盒反应流程常规程序
针法荧光定量pcr试剂盒反应流程常规程序：
将pcr反应所需的成分配置完后，在pcr仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板dna充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成dna，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的dna片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。
2．复性（退火）和延伸温度
复性的温度是pcr扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法pcr。
3．反应时间
变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的g+c含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。
4．循环次数
循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。
平台效应（plateaueffect）：pcr扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dntp和dna聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不*。
5．pcr反应液的配制
pcr反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入dna聚合酶。早期的pcr仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
对于使用具3’-5’外切活性的高温dna聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，a管含模板、引物和dntp，以及调整体积的h2o，b管含缓冲液、dna聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。
按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hotstart）pcr操作方式可较好解决这一问题。将dntp、缓冲液，mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蜡珠（如ampliwaxpcrqam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和dna聚合酶等剩余成分。只有当pcr反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。
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将pcr反应所需的成分配置完后，在pcr仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板dna充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成dna，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的dna片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。
2．复性（退火）和延伸温度
复性的温度是pcr扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法pcr。
3．反应时间
变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的g+c含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。
4．循环次数
循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。
平台效应（plateaueffect）：pcr扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dntp和dna聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不*。
5．pcr反应液的配制
pcr反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入dna聚合酶。早期的pcr仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。
对于使用具3’-5’外切活性的高温dna聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，a管含模板、引物和dntp，以及调整体积的h2o，b管含缓冲液、dna聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。
按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。热启动（hotstart）pcr操作方式可较好解决这一问题。将dntp、缓冲液，mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蜡珠（如ampliwaxpcrqam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和dna聚合酶等剩余成分。只有当pcr反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。
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