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四价mrna疫苗激发针对牛痘和猴痘病毒抗原的有效免疫应答
2022年人类猴痘病毒感染的quanqiu暴发引起了公众对人畜共患疾病人际传播威胁的卫生关注。
鉴于有证据表明，包括牛痘和骆驼痘在内的其他正痘病毒也报告对人类具有传染性，并且存在天花从实验室意外逃逸的风险，此迫切需要开发一种具有广泛预防正痘病毒的痘病毒疫苗，以储备以应对未来的紧急情况。
在这项研究中，我们构建了一种新的痘病毒候选疫苗mrna-alab-lnp，编码牛痘病毒抗原a27、l1、a33和b5。单次免疫后，小鼠即产生强效的抗l1特异性抗体，和中等程度的抗a33-、抗a27 -和抗b5特异性抗体反应。第二次接种后，四种抗原的抗体反应均显著增强，igg滴度均>5 logs，其中抗a33的 igg滴度zuigao。
实验结果
01mrna分子的设计与合成
设计了一个常规的mrna序列，包含帽结构、5'utr非翻译区、cds翻译区、3'utr非翻译区和polya 结构。cds翻译区表达4个串联的vacv抗原分子(a27, l1, a33, b5)被连接体分离，mrna分子命名为mrna- alab。在完整的mrna序列的5'端添加一个t7启动子和在3'端添加一个bspqi限制性内切酶切割位点（图1a）。用bspqi酶切质粒可以有效地线性化质粒模板(图1b)。以线性化质粒为模板，通过体外转录反应合成了mrna-alab分子。琼脂糖凝胶电泳和hplc-sec分析表明，合成mrna具有良好的完整性(图1c)和纯度(图1d)。
图1: mrna-alab的结构设计和制备
02mrna-alab-lnp的制备和表征
本研究中，使用迈安纳微流控设备inano l进行脂质和rna的充分混合，空载lnp和包载了rna的lnp的粒径分别为75nm和84nm（图2b），pdi<0.1显示了良好的均一性，包封率约为98%。转染293t细胞，抗a27, l1, a33, b5的阳性率分别为20%, 85%, 6% 和75%（图3）。
图2: mrna-alab-lnp的准备和表征
图3: 转染mrna-alab-lnp后四种靶蛋白的表达
03mrna-alab-lnp疫苗在小鼠中诱导了强效的抗原特异性结合抗体反应
为了研究mrna疫苗的免疫原性，6-8周龄balb/c小鼠以2周间隔肌肉注射2次疫苗(图4a) ，每次注射剂量为20ug。于shouci注射前3天、第14天(shouci注射后2周)、第28天(shouci注射后4周)和第42天(增强注射后2周)，采血取样，检测抗原特异性结合抗体(图4b-4e)。第二次免疫后45 d取脾进行细胞免疫评价。在diyi次免疫后，诱导了强效的抗l1特异性和中等的抗a33 -、抗a27 -和抗b5特异性抗体反应，并且针对所有四种抗原的抗体反应随着时间的推移而增加。同时，加强免疫后4种抗原的抗体水平显著升高。这些结果表明，mrna -alab- lnp疫苗能够诱导强效的抗原特异性结合抗体反应。
图4：mrna-alab-lnp在小鼠体内引起强效抗体反应
04mrna-alab-lnp疫苗免疫血清展现了强效的痘病毒中和活性
为了确定mrna -alab- lnp疫苗产生的抗体是否具youbing毒中和活性，我们用100 ccid50 vacv病毒和增强疫苗注射后2周的灭活血清孵育，以检测中和活性。通过观察和分级细胞病变效应(cpe)来计算血清中和活性。病毒对照(vc)和空载lnp免疫血清，在1:80的稀释下，未表现出中和活性，感染的bsc-1细胞显示出明显的cpe(图5a)。相反，mrna -alab- lnp接种小鼠的免疫血清，在1：80和1：640和1：1280的稀释下，在感染的bsc-1细胞中未见cpe，显示出细胞免受病毒感染的保护(图5a)。在本实验中，mrna -alab- lnp的平均中和抗体滴度可达1431 (图5b)。
图5：mrna-alab-lnp诱导出抗牛痘病毒的强效中和抗体
05mrna-alab-lnp疫苗在小鼠体内诱导抗原特异性细胞免疫反应
为了探讨mrna疫苗是否能诱导小鼠特异性细胞免疫应答，在增强针注射45 d后收集小鼠脾细胞，分别用elispot法检测针对6种抗原肽文库a27、l1-1、l1-2、a33、b5-1、b5-2的特异性ifn-γ阳性t细胞。对所有四种抗原均检测到特异性ifn-γ应答，且应答显著高于空白lnp免疫对照组(图6a)。a27肽库和a33肽库对ifn-γ的刺激水平较高，分别为904个点/百万细胞和27747个点/百万细胞。与抗a33的总特异性igg应答zuigao一致(图3d)，对a33肽库的应答中ifn-γ应答也zuigao(图6b)。
图6：mrna-alab-lnp诱导小鼠细胞免疫应答(n=4)
06mrna-alab-lnp接种小鼠血清显示针对猴痘病毒同源抗原的高水平交叉结合效应
将mrna-alab-lnp免疫小鼠的免疫血清依次稀释，与4种蛋白a29、m1、220 a35和b6孵育，检测交叉结合抗体滴度。elisa结果显示，shouci免疫后对猴痘抗原a35、m1、222、a29和b6均有较强的血清igg应答，且随着免疫时间的延长，抗体滴度逐渐升高。(图7a- 223 7d)。抗a29抗体平均滴度从2040 (初次免疫后2周)增加到4440 (初次免疫后4周)，抗m1抗体从74520 (初次免疫后2周)增加到184680 (初次免疫后4周)，抗a35抗体从2520 (初次免疫后2周)增加到9000 (初次免疫后4周)，抗b6特异性抗体从5880 (初次免疫后2周)增加到10920 (初次免疫后4周)。此外，增强免疫2周后，4种抗体水平均显著升高，其中抗a29、抗m1、抗a35和抗b6抗体滴度分别达到110000、2430000、558000和1782000。总之，这些结果表明，编码牛痘抗原(a27、l1、232、a33和b5)的mrna-alab-lnp疫苗在小鼠体内诱导了针对各自猴痘抗原(a29、m1、a35和b6)的等效或更好的交叉反应抗体。(图7 a-7d)。
图7：mrna-alab-lnp可诱导针对mpxv抗原的强效交叉反应抗体。
总结综上所述，本研究基于牛痘病毒抗原a27, l1, a33、b5，开发了一种新的四价mrna-alab-lnp疫苗，具有潜在的抗正痘病毒的潜力。该候选疫苗对牛痘病毒和猴痘产生了显著的抗体应答。这些数据证明了mrna-alab- 282 lnp疫苗设计的可行性，并提供了其作为广泛的正痘病毒候选疫苗的潜力的初步证据。
文献来源：
su et al., a quadrivalent mrna immunization elicits potent immune responses against vaccinia and monkeypox viral antigens – a step closer to a broad orthopoxvirus vaccine. biorxiv. doi: 10.1101/2023.04.23.537951.
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在这项研究中，我们构建了一种新的痘病毒候选疫苗mrna-alab-lnp，编码牛痘病毒抗原a27、l1、a33和b5。单次免疫后，小鼠即产生强效的抗l1特异性抗体，和中等程度的抗a33-、抗a27 -和抗b5特异性抗体反应。第二次接种后，四种抗原的抗体反应均显著增强，igg滴度均>5 logs，其中抗a33的 igg滴度zuigao。
实验结果
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设计了一个常规的mrna序列，包含帽结构、5'utr非翻译区、cds翻译区、3'utr非翻译区和polya 结构。cds翻译区表达4个串联的vacv抗原分子(a27, l1, a33, b5)被连接体分离，mrna分子命名为mrna- alab。在完整的mrna序列的5'端添加一个t7启动子和在3'端添加一个bspqi限制性内切酶切割位点（图1a）。用bspqi酶切质粒可以有效地线性化质粒模板(图1b)。以线性化质粒为模板，通过体外转录反应合成了mrna-alab分子。琼脂糖凝胶电泳和hplc-sec分析表明，合成mrna具有良好的完整性(图1c)和纯度(图1d)。
图1: mrna-alab的结构设计和制备
02mrna-alab-lnp的制备和表征
本研究中，使用迈安纳微流控设备inano l进行脂质和rna的充分混合，空载lnp和包载了rna的lnp的粒径分别为75nm和84nm（图2b），pdi<0.1显示了良好的均一性，包封率约为98%。转染293t细胞，抗a27, l1, a33, b5的阳性率分别为20%, 85%, 6% 和75%（图3）。
图2: mrna-alab-lnp的准备和表征
图3: 转染mrna-alab-lnp后四种靶蛋白的表达
03mrna-alab-lnp疫苗在小鼠中诱导了强效的抗原特异性结合抗体反应
为了研究mrna疫苗的免疫原性，6-8周龄balb/c小鼠以2周间隔肌肉注射2次疫苗(图4a) ，每次注射剂量为20ug。于shouci注射前3天、第14天(shouci注射后2周)、第28天(shouci注射后4周)和第42天(增强注射后2周)，采血取样，检测抗原特异性结合抗体(图4b-4e)。第二次免疫后45 d取脾进行细胞免疫评价。在diyi次免疫后，诱导了强效的抗l1特异性和中等的抗a33 -、抗a27 -和抗b5特异性抗体反应，并且针对所有四种抗原的抗体反应随着时间的推移而增加。同时，加强免疫后4种抗原的抗体水平显著升高。这些结果表明，mrna -alab- lnp疫苗能够诱导强效的抗原特异性结合抗体反应。
图4：mrna-alab-lnp在小鼠体内引起强效抗体反应
04mrna-alab-lnp疫苗免疫血清展现了强效的痘病毒中和活性
为了确定mrna -alab- lnp疫苗产生的抗体是否具youbing毒中和活性，我们用100 ccid50 vacv病毒和增强疫苗注射后2周的灭活血清孵育，以检测中和活性。通过观察和分级细胞病变效应(cpe)来计算血清中和活性。病毒对照(vc)和空载lnp免疫血清，在1:80的稀释下，未表现出中和活性，感染的bsc-1细胞显示出明显的cpe(图5a)。相反，mrna -alab- lnp接种小鼠的免疫血清，在1：80和1：640和1：1280的稀释下，在感染的bsc-1细胞中未见cpe，显示出细胞免受病毒感染的保护(图5a)。在本实验中，mrna -alab- lnp的平均中和抗体滴度可达1431 (图5b)。
图5：mrna-alab-lnp诱导出抗牛痘病毒的强效中和抗体
05mrna-alab-lnp疫苗在小鼠体内诱导抗原特异性细胞免疫反应
为了探讨mrna疫苗是否能诱导小鼠特异性细胞免疫应答，在增强针注射45 d后收集小鼠脾细胞，分别用elispot法检测针对6种抗原肽文库a27、l1-1、l1-2、a33、b5-1、b5-2的特异性ifn-γ阳性t细胞。对所有四种抗原均检测到特异性ifn-γ应答，且应答显著高于空白lnp免疫对照组(图6a)。a27肽库和a33肽库对ifn-γ的刺激水平较高，分别为904个点/百万细胞和27747个点/百万细胞。与抗a33的总特异性igg应答zuigao一致(图3d)，对a33肽库的应答中ifn-γ应答也zuigao(图6b)。
图6：mrna-alab-lnp诱导小鼠细胞免疫应答(n=4)
06mrna-alab-lnp接种小鼠血清显示针对猴痘病毒同源抗原的高水平交叉结合效应
将mrna-alab-lnp免疫小鼠的免疫血清依次稀释，与4种蛋白a29、m1、220 a35和b6孵育，检测交叉结合抗体滴度。elisa结果显示，shouci免疫后对猴痘抗原a35、m1、222、a29和b6均有较强的血清igg应答，且随着免疫时间的延长，抗体滴度逐渐升高。(图7a- 223 7d)。抗a29抗体平均滴度从2040 (初次免疫后2周)增加到4440 (初次免疫后4周)，抗m1抗体从74520 (初次免疫后2周)增加到184680 (初次免疫后4周)，抗a35抗体从2520 (初次免疫后2周)增加到9000 (初次免疫后4周)，抗b6特异性抗体从5880 (初次免疫后2周)增加到10920 (初次免疫后4周)。此外，增强免疫2周后，4种抗体水平均显著升高，其中抗a29、抗m1、抗a35和抗b6抗体滴度分别达到110000、2430000、558000和1782000。总之，这些结果表明，编码牛痘抗原(a27、l1、232、a33和b5)的mrna-alab-lnp疫苗在小鼠体内诱导了针对各自猴痘抗原(a29、m1、a35和b6)的等效或更好的交叉反应抗体。(图7 a-7d)。
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