疫苗中mRNA成分和LNP递送系统的功能和特征及其对疫苗稳定性影响
mrna疫苗概述
mrna-lnp 疫苗的组成是其稳定性的基础。在针对病毒的疫苗开发过程中，已经有多种不同的 mrna 候选疫苗。目前，有10种不同的针对的mrna疫苗已进入临床试验，包括常规 mrna疫苗和自扩增 mrna (sam)。目前有三种“常规”可编码完整的s蛋白的mrna 疫苗已获批或处于临床试验后期。它们是 moderna 的 mrna-1273 疫苗、biontech/pfizer 的 bnt162b2/comirnaty 和 curevac 的 cvncov（可见表1）。
有几篇综述对这三种的 mrna疫苗进行了详细比较，包括它们在 mrna 结构和lnp设计方面的差异和相似之处。以下部分旨在概述这些疫苗中mrna 成分和 lnp递送系统的功能和特征，因为它们对 mrna 疫苗的体内给药和储存期间的稳定性起着关键作用。
表1 有关目前上市使用或临床 iii 期试验的三种 mrna-lnp疫苗的信息，出于比较原因，添加了 onpattro（一种 sirna-lnp 药物产品）的药物产品信息。
* ndaonpattro (patisiran) 脂质复合物注射液；药品质量审查附录（fda，2017 年）。
a n = 可电离的阳离子脂质（氮），p = 核苷酸（磷酸盐）。
b推测
2.1 优化mrna体内稳定性和翻译能力的mrna工程
mrna由于其磷酸基团上带有负电荷，在生理 ph 范围内是以聚阴离子大分子的形式存在。递送mrna 疫苗的个障碍是由于核糖核酸酶在细胞外环境中含量丰富，裸露的mrna在注射后容易被核糖核酸酶 (rnase) 迅速降解。其次， mrna进入细胞会被细胞内rna受体识别，包括内体toll 样受体 (tlr) 和细胞质核酸受体。mrna与这些宿主防御受体的结合会激活先天免疫通路，会导致数百个基因的表达。一方面，这可以为疫苗提供佐剂样作用。另一方面，它导致细胞处于抗病毒状态，这强烈降低了细胞内mrna的稳定性和翻译表达。摄取进入细胞后， mrna 链需要与核糖体结合以实现所编码蛋白质的翻译表达。可以通过mrna工程显著改善mrna 的蛋白质合成速率和功能半衰期，mrna疫苗中的mrna链的典型元件示意图如图1所示。
图1 体外转录 (ivt) mrna 的结构元件。这些序列中的每一个部分都可以优化和修改，以调节mrna 的稳定性、翻译能力和免疫激活能力。
有很多研究尝试提高mrna 分子的体内稳定性和翻译能力，同时避免不需要的先天免疫激活。目前达成共识的是，这可以通过优化 mrna 的调控区域5' 帽、poly-a 尾和非翻译区 (utr)来实现。utr位于mrna 编码区的两侧，可以调节mrna的稳定性和翻译。
poly-a尾也能调节mrna的稳定性，因为它的缩短和去除都会导致 mrna 的降解。5' 帽结构对于蛋白质生产和翻译启动子的结合很重要。此外，具有 gc（-胞嘧啶）含量的mrna 结合密码子优化，即在编码区选择“常用密码子”，可提高稳定性和翻译水平。
另一个关键因素是mrna的二级结构，它可以通过密码子优化和计算工具来改变一级序列使其稳定。通过选择“高度结构化的编码序列”在mrna中构建二级结构 （除了5' utr 区域）也会产生更高的体内翻译水平，因为mrna体内半衰期得到延长。或者，mauger等人证明天然存在的修饰尿苷的引入，例如使用1-甲基-假尿苷（m1ψ）代替尿苷，会带来mrna二级结构的整体变化，从而达到更高水平的蛋白质表达。
重要的是，目前将rna结合蛋白对mrna的胞内识别降至的方法是在mrna中引入这些修饰的尿苷，这些蛋白参与对外来mrna的先天免疫反应，反过来增强了生物稳定性和翻译能力，同时降低了mrna 疫苗的免疫原性。此外，还有迹象表明，m1ψ 提高了mrna 的碱基堆积和熔点，从而使mrna更加稳定。
这可能意味着 moderna 和 biontech/pfizer 的疫苗，1mψ的掺入也会提高给药前mrna 的稳定性。最近有文章发表了对 curevac在 cvncov mrna 工程中所做工作的有趣分析，curevac 采用了不同的策略。然而，即使优化了mrna的结构，直接注射裸露的mrna 也不会引起强烈的免疫反应，这可能是因为裸露的mrna的细胞转染能力差和对rna酶（rnase）敏感。这说明仅优化mrna结构不足以创建有效的 mrna 疫苗，仍然需要额外的保护和递送系统。
另一种类型的 mrna 疫苗sams不仅编码目标抗原，还编码rna 聚合酶——来自病毒的“自我放大”因子。通常，sams由 9 kb 的mrna核苷酸组成，而非自我复制的mrna疫苗的序列长度仅为2-4 kb。开发 sam 候选疫苗的目的是替代典型的两剂策略的“启动-加强”方案，而是达到每位接种者单次注射。由于自带的复制能力，sam疫苗的注射剂量低于传统mrna疫苗，一剂便可能达到足够保护效力。
当 sam 在宿主细胞中被翻译时，一种rna聚合酶合成与编码mrna 模板互补的反义rna中间体，再转录为许多编码mrna 分子，从而使抗原表达延长和增强。目前两种 sam 疫苗都编码完整的s 蛋白，并且这些疫苗在临床试验中的剂量比常规mrna 疫苗的典型剂量低十倍以上。临床开发中的两种sam 疫苗是伦敦帝国理工学院的ncovsarna 和 arcturus/duke-nus 的 arct-021，两种疫苗均采用的是lnp包裹技术。
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氯离子电通量测定仪测试步骤
真空管式加热管式炉操作步骤
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五个错误的操作可导致DTRO膜损坏
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橡塑保温板厂家 认准河北神州
详解下硅片单面减薄设备的应用
mrna-lnp 疫苗的组成是其稳定性的基础。在针对病毒的疫苗开发过程中，已经有多种不同的 mrna 候选疫苗。目前，有10种不同的针对的mrna疫苗已进入临床试验，包括常规 mrna疫苗和自扩增 mrna (sam)。目前有三种“常规”可编码完整的s蛋白的mrna 疫苗已获批或处于临床试验后期。它们是 moderna 的 mrna-1273 疫苗、biontech/pfizer 的 bnt162b2/comirnaty 和 curevac 的 cvncov（可见表1）。
有几篇综述对这三种的 mrna疫苗进行了详细比较，包括它们在 mrna 结构和lnp设计方面的差异和相似之处。以下部分旨在概述这些疫苗中mrna 成分和 lnp递送系统的功能和特征，因为它们对 mrna 疫苗的体内给药和储存期间的稳定性起着关键作用。
表1 有关目前上市使用或临床 iii 期试验的三种 mrna-lnp疫苗的信息，出于比较原因，添加了 onpattro（一种 sirna-lnp 药物产品）的药物产品信息。
* ndaonpattro (patisiran) 脂质复合物注射液；药品质量审查附录（fda，2017 年）。
a n = 可电离的阳离子脂质（氮），p = 核苷酸（磷酸盐）。
b推测
2.1 优化mrna体内稳定性和翻译能力的mrna工程
mrna由于其磷酸基团上带有负电荷，在生理 ph 范围内是以聚阴离子大分子的形式存在。递送mrna 疫苗的个障碍是由于核糖核酸酶在细胞外环境中含量丰富，裸露的mrna在注射后容易被核糖核酸酶 (rnase) 迅速降解。其次， mrna进入细胞会被细胞内rna受体识别，包括内体toll 样受体 (tlr) 和细胞质核酸受体。mrna与这些宿主防御受体的结合会激活先天免疫通路，会导致数百个基因的表达。一方面，这可以为疫苗提供佐剂样作用。另一方面，它导致细胞处于抗病毒状态，这强烈降低了细胞内mrna的稳定性和翻译表达。摄取进入细胞后， mrna 链需要与核糖体结合以实现所编码蛋白质的翻译表达。可以通过mrna工程显著改善mrna 的蛋白质合成速率和功能半衰期，mrna疫苗中的mrna链的典型元件示意图如图1所示。
图1 体外转录 (ivt) mrna 的结构元件。这些序列中的每一个部分都可以优化和修改，以调节mrna 的稳定性、翻译能力和免疫激活能力。
有很多研究尝试提高mrna 分子的体内稳定性和翻译能力，同时避免不需要的先天免疫激活。目前达成共识的是，这可以通过优化 mrna 的调控区域5' 帽、poly-a 尾和非翻译区 (utr)来实现。utr位于mrna 编码区的两侧，可以调节mrna的稳定性和翻译。
poly-a尾也能调节mrna的稳定性，因为它的缩短和去除都会导致 mrna 的降解。5' 帽结构对于蛋白质生产和翻译启动子的结合很重要。此外，具有 gc（-胞嘧啶）含量的mrna 结合密码子优化，即在编码区选择“常用密码子”，可提高稳定性和翻译水平。
另一个关键因素是mrna的二级结构，它可以通过密码子优化和计算工具来改变一级序列使其稳定。通过选择“高度结构化的编码序列”在mrna中构建二级结构 （除了5' utr 区域）也会产生更高的体内翻译水平，因为mrna体内半衰期得到延长。或者，mauger等人证明天然存在的修饰尿苷的引入，例如使用1-甲基-假尿苷（m1ψ）代替尿苷，会带来mrna二级结构的整体变化，从而达到更高水平的蛋白质表达。
重要的是，目前将rna结合蛋白对mrna的胞内识别降至的方法是在mrna中引入这些修饰的尿苷，这些蛋白参与对外来mrna的先天免疫反应，反过来增强了生物稳定性和翻译能力，同时降低了mrna 疫苗的免疫原性。此外，还有迹象表明，m1ψ 提高了mrna 的碱基堆积和熔点，从而使mrna更加稳定。
这可能意味着 moderna 和 biontech/pfizer 的疫苗，1mψ的掺入也会提高给药前mrna 的稳定性。最近有文章发表了对 curevac在 cvncov mrna 工程中所做工作的有趣分析，curevac 采用了不同的策略。然而，即使优化了mrna的结构，直接注射裸露的mrna 也不会引起强烈的免疫反应，这可能是因为裸露的mrna的细胞转染能力差和对rna酶（rnase）敏感。这说明仅优化mrna结构不足以创建有效的 mrna 疫苗，仍然需要额外的保护和递送系统。
另一种类型的 mrna 疫苗sams不仅编码目标抗原，还编码rna 聚合酶——来自病毒的“自我放大”因子。通常，sams由 9 kb 的mrna核苷酸组成，而非自我复制的mrna疫苗的序列长度仅为2-4 kb。开发 sam 候选疫苗的目的是替代典型的两剂策略的“启动-加强”方案，而是达到每位接种者单次注射。由于自带的复制能力，sam疫苗的注射剂量低于传统mrna疫苗，一剂便可能达到足够保护效力。
当 sam 在宿主细胞中被翻译时，一种rna聚合酶合成与编码mrna 模板互补的反义rna中间体，再转录为许多编码mrna 分子，从而使抗原表达延长和增强。目前两种 sam 疫苗都编码完整的s 蛋白，并且这些疫苗在临床试验中的剂量比常规mrna 疫苗的典型剂量低十倍以上。临床开发中的两种sam 疫苗是伦敦帝国理工学院的ncovsarna 和 arcturus/duke-nus 的 arct-021，两种疫苗均采用的是lnp包裹技术。
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