高浓度葡萄糖对周细胞样分化的人脂肪源性间充质干细胞的影响
在过去的几十年中，人脂肪源性间充质干细胞（ascs）的多向分化能力因其在基于干细胞的治疗策略中的潜在应用而得到了广泛的研究。目前正在探索基于干细胞的疗法来治疗眼部疾病，包括糖尿病视网膜病变（dr），其中血管并发症导致血-视网膜屏障（brb）破坏。
微循环损伤主要归因于周细胞的不可逆丢失，这是dr的早期标志，因为在成人视网膜中，周细胞无法复制。高血糖引起的活性氧（ros）的过量产生刺激炎症过程，导致视网膜血管损伤。在dr患者中发现不同炎性细胞因子（如il-1β）和肿瘤坏死因子-α（tnf-α）水平升高。活化的小胶质细胞、内皮细胞和大胶质细胞参与这些细胞因子的分泌，其积累有助于神经元死亡。此外，血管内皮生长因子（vegf）和血管生成素-2等促血管生成因子已被证明可诱导内皮细胞增殖，最终导致血管通透性增加和破裂。
基于干细胞的疗法可能是抵消周细胞丢失和减缓疾病进展的宝贵工具。体外实验和dr小鼠模型曾报道了令人鼓舞的结果。在意大利卡塔尼亚大学生物医学与生物技术科学系团队之前的体外研究中，通过在专为周细胞（pm）设计的培养基中培养ascs，实现了ascs的周细胞样分化。结果，获得了平滑肌肌动蛋白α（α-sma）和神经胶质抗原2（ng2）的过表达，以及它们典型的肾小管周围定位。此外，周细胞样分化ascs和人视网膜内皮细胞（hrecs）的共培养诱导了连接蛋白的表达增加。它们也将被称为pmascs，因为它们的分化过程也是通过使用pm实现的。
该团队下一项研究的目的是进一步探索通过相同分化方案获得的这些pmascs的行为，特别是，为了模拟糖尿病患者发生的状况，在向培养基中加入葡萄糖后测量和比较各种参数。实验评估了细胞增殖、细胞活力及其迁移能力；还测量了ros的产生以及促炎（tnf-α和il-1β）和抗炎（tgf-β1和il-10）细胞因子、促血管生成因子（vegf，血管生成素-2和mmp-9）的mrna表达；最后通过3d共培养评估了pmasc对hrec组织管状形成能力的影响。在这些结果中获得的周细胞样ascs代表了治疗糖尿病患者视网膜损伤的宝贵数据。
首先，进行细胞增殖和活性检测。尽管存在显著差异，但在所有测试的asc群体中均观察到高增殖率。图1显示了所研究的所有四个亚组中典型的成纤维细胞样形态。可以观察到，无论葡萄糖浓度如何，pmasc培养物中存在更密集的细胞群（图1 b、d），在较长时间内可能会注意到轻微下降。添加葡萄糖对这些细胞种群的影响不显著。相反，高葡萄糖浓度对人视网膜周细胞（hrpcs）的增殖率产生负面影响，其增殖率逐渐降低，特别是在葡萄糖添加72小时。通过mtt测定细胞活力，pmascs与ascs在每个时间点的任何葡萄糖浓度下都显示出相似的高值，相反，在hrpc种群中测量到较低值，添加葡萄糖48小时和72小时后逐渐观察到显著下降。
图1 在基础培养基（asc）或周细胞培养基（pmasc）中培养的人脂肪间充质干细胞的代表性显微照片，在细胞增殖测定期间用结晶紫染色。在各自的培养基中生长三天后，在一些样本（高葡萄糖，25 mm）中添加葡萄糖，而其他样本则保持在正常葡萄糖（ng）状态。在葡萄糖添加72小时后拍摄照片，并与ng对照进行比较。四个亚组为a：asc ng；b: pmasc ng；c: asc hg；d: pmasc hg。
接下来，与hrpcs相比，进行了伤口愈合测定以评估不同asc亚组的细胞迁移能力（图2 a）。数据显示，在ng条件下培养时，ascs和pmascs在48小时的观察期内表现出显著的迁移能力，伤口愈合率约为70%（图2 b）。将葡萄糖加入培养基（hg）时观察到显著差异，与pmascs相比，ascs（伤口愈合率约为35%）明显显示出相反的趋势。在伤口愈合率约为70% 的hrpcs 中观察到中间值（图2 c）。hg条件下，pmascs的相关细胞迁移能力在48小时时尤为明显。
图2 通过基础培养基（asc）或周细胞培养基（pmasc）中培养的人脂肪间充质干细胞以及人视网膜周细胞（hrpc）培养物中的伤口愈合测定评估细胞迁移能力。（a）在划痕（0小时），培养24小时和48小时后每个样品的代表性照片。量化asc和pm asc培养（b）和hrpc培养（c）的伤口愈合百分比。
然后评估了每个asc亚组和hrpc群的ros水平，在观察期内，asc种群中ros水平逐渐增加，而pmascs在每个相应时间点检测到稳定且显著降低的水平。加入葡萄糖后，每个asc组内未观察到明显变化，而在hrpc培养组中观察到不同的趋势，72小时后观察到其显著更高的ros水平。
在进一步的实验中，在ng和hg条件下，通过定量rt-pcr分析asc和pmasc培养物中炎症相关细胞因子mrna水平（图3）。在ng条件下培养时，ascs和pmascs之间的抗炎细胞因子il-10 mrna表达没有明显差异，而在hg条件下，asc培养物中略高的il-10 mrna水平在pmascs中增加了25倍。此外，与asc培养物相比，pmasc培养物中的tgf-β1 mrna水平升高，特别是在hg条件下。在ng条件下asc和pmasc培养物中检测到相似的促炎细胞因子tnf-α mrna水平，而在hg条件下，与ascs中更显著的增加相比，pmasc仅观察到微弱升高的水平。与ascs相比，ng条件下的il-1β mrna水平在pmasc中显著降低，而在hg培养中，ascs中测量的水平较低，而pmascs中没有显著差异。
此外，评估了血管生成因子vegf，血管生成素-2和mmp9的mrna表达水平。在hg培养的asc中，vegf和血管生成素-2值均增加，而在pmascs中的较低水平未受显著影响。mmp9 mrna在ng条件下水平较低，添加葡萄糖后在ascs中显著更高，在pmascs中甚至更低。这些数据表明，炎症基因的调节有利于抗炎表型，同时，血管生成因子普遍降低。
图3 高葡萄糖对在基础培养基（asc）或周细胞培养基（pmasc）中培养的人脂肪间充质干细胞中的抗炎和促炎细胞因子以及血管生成因子的影响。通过qrt-pcr评估il 10（a）、tgf-β1（b）、tnfα（c）、il-1β（d）、vegf（e）、血管生成素-2（f）和mmp9（g）mrna水平的定量分析。
最后，在3d共培养中测试了hrecs与ascs或pmascs之间的相互作用，分析了hrec自组装的管状结构引起的修饰（图4 a）。定量数据显示，在hg与ng条件下，hrecs 的小管总主干长度值较低（图4 b），与ascs共培养时也是如此，相反，与pmascs共培养的hrecs测量到更高的值。在hg与ng条件下，对于总分离分支长度（图4 c）呈相反趋势，hrecs和 hrecs + ascs 产生更高的值，而hrecs + pmascs的值明显较低。图4 d所示的分支点测量值与主干和分离分支长度值非常吻合。添加葡萄糖后，hrecs和hrecs + ascs共培养中的分支点数较低，hrecs + pmascs的共培养中分支点数较高。正如预期的那样，分支点的数量随着总主干长度值的增加而成比例增加，并且与总分离分支长度成反比。这可能表明，同样在高葡萄糖条件下，周细胞样ascs的存在会诱导更有组织的血管网络。
图4 高葡萄糖对人视网膜内皮细胞（hrec）或与ascs（hrec + asc）或pmascs（hrec + pmasc）共培养的管状结构形成的影响。（a）代表性显微照片显示了每个样本的基质胶中的3d培养物。底部的直方图显示total master segment length “总主干长度”（b）、total isolated branch length“总分离分支长度”（c）和branching points “分支点”（d）。
总之，这项工作获得的结果令人鼓舞，因为即使在高葡萄糖浓度存在的情况下，周细胞样ascs也具有显著的活力，高增殖率和显著的迁移能力。此外，观察到ros，促炎细胞因子和促血管生成因子的产生减少，以及抗炎细胞因子的产生增加。最后，对hrec管状形成结果观察到了积极的影响，这些表明，特定的上游处理有助于优化基于干细胞的治疗应用。当这些周细胞样ascs植入体内时，这些在体外获得的结果是否真的提供了有益的效果，还有待验证。
参考文献：mannino g, longo a, gennuso f, anfuso cd, lupo g, giurdanella g, giuffrida r, lo furno d. effects of high glucose concentration on pericyte-like differentiated human adipose-derived mesenchymal stem cells. int j mol sci. 2021 apr 27;22(9):4604. doi: 10.3390/ijms22094604. pmid: 33925714; pmcid: pmc8125146.
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图2 通过基础培养基（asc）或周细胞培养基（pmasc）中培养的人脂肪间充质干细胞以及人视网膜周细胞（hrpc）培养物中的伤口愈合测定评估细胞迁移能力。（a）在划痕（0小时），培养24小时和48小时后每个样品的代表性照片。量化asc和pm asc培养（b）和hrpc培养（c）的伤口愈合百分比。
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图4 高葡萄糖对人视网膜内皮细胞（hrec）或与ascs（hrec + asc）或pmascs（hrec + pmasc）共培养的管状结构形成的影响。（a）代表性显微照片显示了每个样本的基质胶中的3d培养物。底部的直方图显示total master segment length “总主干长度”（b）、total isolated branch length“总分离分支长度”（c）和branching points “分支点”（d）。
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