使用全自动液体萃取平台ATLAS-LEXT从生物试样中提取滥用药物
提升生物样品中的毒物、du品分析预处理流程的自动化程度有助于简化工作流程，降低操作者感染风险和操作失误发生的可能。样品自动化预处理也可提高检测数据的重现性和定量分析的准确性。与传统预处理方法相比：
① 全自动液体萃取平台atlas-lext配备自动化的移液、振荡和离心操作单元可提高样品预处理处理精度。
② 全自动液体萃取平台atlas-lext可实现多工作流程并行处理功能并以此提高样品预处理的样品制备通量。
本应用介绍了学会发表的以生物试样(血液、尿液、毛发)中的滥用药物和代谢物为目标物萃取物、利用atlas-lext进行样品预处理程序的开发及方法学评价相关应用信息1)。此外，本文还介绍了alas-lext的样品预处理流程，通过萃取溶剂的优化制备适用于液相色谱质谱和气相色谱质谱适用的待测样品萃取液。
实验方法
? 试剂
甲基ben丙胺(methamphetamine)、弗拉卡α-pvp及其代谢物(1-oh-α-pvp)、氯an酮(ketamine)吗啡(morphine)可ka因 (cocaine)、苯甲酰爱岗宁(benzoylecgonine)以及四氢大ma酸(thc-cooh)的全血、尿液(添加浓度为25 ng/ml~5 μg/ml)以及毛发(通过研磨粉碎提取方法制得悬浮液，添加浓度0.5 ng/mg)
? 预处理
全血的自动试样制备:全血试样开发了2种制备方法：甲醇沉淀法和液-液萃取法。甲醇沉淀法+atlas-lext的自动预处理流程见图1。取试样(用去离子水将添加上述药物的全血样品稀释2.5倍)500μl，移入试管，加甲醇1000μl，振荡5秒钟，2000 ×g下离心280秒，然后移取上清液800 μl。同时重复提取操作2次，合并2次萃取液，加0.3 mol/l盐酸酸化的乙醇溶液(1:40)100 μl，用氮气吹干，加10%甲醇水溶液(275μl)，混合60秒钟以重新溶解，2000×g下离心5分钟，然后移取上清液250μl，注入lc-ms/ms自动进样器的小瓶。(所需时间:每个试样约24分钟。采用并行处理流程可缩短处理时间约33%)
图1 甲醇沉淀法对滥用药物的自动提取流程
? 尿液的自动样品预处理
液-液萃取法+atlas-lext的自动预处理流程见图2。取尿液试样500μl，放入瓶中，加1.0mol/l的碳酸盐缓冲液80μl，将调节ph=9，加氯仿：2-丙醇(3:1)1200μl，振荡75秒钟，2000×g下离心90秒钟。防乳化自动检测，移取溶剂下层溶液800μl。重复提取操作3次，合并3次萃取液，加0.3mol/l盐酸酸化乙醇溶液(1:40)70μl，氮气吹干，加10%甲醇水溶液(275μl)，振荡60秒钟以重新溶解，2000×g下离心6分钟，然后吸取上清液250μl，注入lc-ms/ms自动进样器的小瓶。(所需时间:每个试样约17分钟。并行处理可缩短处理时间约30%)
? 毛发的自动样品预处理
取毛发10mg，用50mm乙酸盐缓冲液(ph5.0)800μl，预先粉碎并制备悬浮液，采用液-液萃取法并通过atlas-lext进行自动预处理。(参照图2)(所需时间：每个试样约23分钟)
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图2 液-液萃取法对滥用药物的自动提取流程
? 回收率的测定
使用配制浓度为50ng/ml的全血添加样品和尿液样品、配制浓度为0.5 ng/mg毛发添加样品(通过研磨粉碎提取方法制得悬浮液)，并通过atlas-lext进行全自动预处理，制得样品后，添加内标阿普唑仑-d5，分析并计算回收率。
? 定量限及残留实验
在0.1~200ng/ml的范围内制作每种待测物的标准曲线。添加样品连续处理后测定空白样品，验证没有残留物。
? lc-ms/ms条件
lc：岛津uflc prominence、ms：电离：esi(positive)、色谱柱: l-column 2 ods(1.5mm i.d.×150mm，5μm)、流动相：10mm 乙酸铵水溶液及甲醇[5%-(15min)–95%(10min)、柱温：40℃、流速：0.1ml/min。向上述制备试样添加阿普唑仑-d5(内标)溶液， mrm模式下进行分析。
实验结果与考察
? 回收率验证
各药物的回收率见表1。采用甲醇沉淀法从全血(用水稀释2.5倍，500μl)中预处理并计算du品(添加浓度50ng/ml)萃取回收率，均在62~71%的范围内，rsd小于14%，满足回收率要求。采用液-液萃取法从500μl尿液中预处理并计算du品(添加浓度50ng/ml)萃取回收率，除酸性物质thccooh外，其他药物的回收率均在62~100%的范围内，rsd小于17%，满足回收率要求。以浓度0.5ng/mg du品成分毛发添样品10mg预处理并计算萃取回收率，苯甲酰爱岗宁的回收率为54%，其它药物的回收率为71~94%，rsd小于9%，重复性、精密度稳定。
表1 各种du品回收率(%)
? 定量限验证
对于添加到全血中的各药物，根据内标法绘制的标准曲线结果见图3。所有标准曲线在0.1 - 200ng/ml的范围内均呈现良好线性关系。
图3 从全血中提取药物并通过lc-ms/ms进行定量分析的标准曲线
? 残留实验
连续处理5个高浓度试样后，对空白试样进行预处理，通过lc-ms/ms进行高灵敏度分析，未检测出药物峰，确认没有残留物。
总结
atlas-lext是一款搭载高速离心(2000×g)单元和配有一次性枪头精密移液单元的自动预处理装置，岛津开发了生物样品(血液、尿液、毛发)中的滥用药物(du品)提取程序，并验证方法学有效性。结果表明，atlas-lext可代替传统手工操作流程，以自动化的流程实现自动化预样品操作。
1. 具备乳化监测组件，有效防止易与生物样品发生乳化的氯仿-2-丙醇(3:1)并通过液-液萃取法萃取生物样品中的du品成分，并实现了样品制备工艺全自动。
2. 可采用血液样品蛋白质甲醇沉淀萃取法，实现了样品制备工艺全自动。
3. 实现毛发样品中痕量药物的样品制备工艺全自动。
4. 有效减少样品间的交叉污染，具备良好的定量分析样品预处理能力。
atlas-lexttm的自动预处理流程编辑示例
* 参考文献：日本法中毒学会第37届年会演讲摘要集p-04
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① 全自动液体萃取平台atlas-lext配备自动化的移液、振荡和离心操作单元可提高样品预处理处理精度。
② 全自动液体萃取平台atlas-lext可实现多工作流程并行处理功能并以此提高样品预处理的样品制备通量。
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图1 甲醇沉淀法对滥用药物的自动提取流程
? 尿液的自动样品预处理
液-液萃取法+atlas-lext的自动预处理流程见图2。取尿液试样500μl，放入瓶中，加1.0mol/l的碳酸盐缓冲液80μl，将调节ph=9，加氯仿：2-丙醇(3:1)1200μl，振荡75秒钟，2000×g下离心90秒钟。防乳化自动检测，移取溶剂下层溶液800μl。重复提取操作3次，合并3次萃取液，加0.3mol/l盐酸酸化乙醇溶液(1:40)70μl，氮气吹干，加10%甲醇水溶液(275μl)，振荡60秒钟以重新溶解，2000×g下离心6分钟，然后吸取上清液250μl，注入lc-ms/ms自动进样器的小瓶。(所需时间:每个试样约17分钟。并行处理可缩短处理时间约30%)
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表1 各种du品回收率(%)
? 定量限验证
对于添加到全血中的各药物，根据内标法绘制的标准曲线结果见图3。所有标准曲线在0.1 - 200ng/ml的范围内均呈现良好线性关系。
图3 从全血中提取药物并通过lc-ms/ms进行定量分析的标准曲线
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总结
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2. 可采用血液样品蛋白质甲醇沉淀萃取法，实现了样品制备工艺全自动。
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