RNA完整 BCT™：一种新型的收集管瞄准循环的 RNA 和细胞外囊泡
简介精密医学，特别是医学肿瘤学，已经显著启用，并加快了步伐，以液体活检为基础的诊断的出现。虽然针对循环无细胞dna（cfdna）的液体活检分析提供了有用的诊断信息，如突变负担，但由于从垂死的细胞中衍生出cfdna，这些检测*于对疾病状态的静态评估。利用循环细胞外囊泡（ev）和ev相关货物（如无细胞rna（cfrna））的检测，这些分析物从活细胞和垂死的细胞中产生，为疾病提供了全面和动态的视图。使用 ev 和 cfrna 进行液体活检测试的一个重要障碍是捐赠者标本的完整性。采集的患者血液样本经过时间依赖性降解，导致疾病非特异性 ev 和 cfrna 增加，从而降低分析素测量的准确性和可重复性。为了克服这个脆弱性，我们开发了streck rna完整bct（rnac），这是其血液采集管，用于稳定细胞外囊泡和无细胞rna的绘制时间浓度。样品完整性将有利于有兴趣直接分析ev组和间接分析cfrna通过rt-pcr或下一代基于测序的方法。将此收集管纳入预分析工作流程将允许长途运输、批量和/或延迟样品处理，而对样品完整性或下游分析产生影响。
材料与方法
血浆样本制备：根据 irb（内奥马哈克里顿大学），通过病毒#830575从健康献血者那里采集血液样本。等离子体使用一般双旋协议（1800 g x 15min 和 2800 g x 15 分钟）进行隔离，并在 -80 oc 下冷冻，直到使用。
ev分析：使用nanosight ns300仪器（马尔文潘纳利科有限公司）对ev浓度和颗粒尺寸进行检测。冷冻血浆样品迅速解冻，在pbs中稀释1：50-1：500，并根据制造商的建议进行测定。
cfrna分离和分析：血浆样品被迅速解冻，总核酸被分离使用qiaamp循环核酸套件根据制造商的建议mirna协议（qiagen公司）。样品解，从30分钟增加到60分钟。结转dna耗尽，cfrna使用无rnasednase集和rneasy minelute清理套件（均来自奇根）进行浓缩。无细胞rna分析使用2100生物分析器与rna 6000笔克套件（安捷伦技术公司，美国圣克拉拉）和qubit rna hs测定试剂盒（塞默-菲舍尔），都根据制造商的建议。
rna-seq： 无细胞rna使用nebnext rrna消耗试剂盒耗尽rrna，然后使用nebnext超ii定向rna库制备试剂盒进行测序，两者均根据所提供的说明。库被量化（nebnext 库量化套件，用于照明）和大小使用在 4200 磁带站系统 （agilent） 上运行的高灵敏度 d1000 屏幕磁带确定。使用高输出 v2.5 测序套件（illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州）在 illumina nextseq 550 上对库进行池化和排序。所有数据都已输出并保存到基于云的 basespace 服务器 （illumina）。读取与人类基因组对齐，并分别使用 basespace 应用程序 top-hat 对齐和 deseq2 完成差异表达式。
结果细胞外囊泡的绘制时间浓度的维持
图1.在环境温度下储存时，rnac 样品中保持细胞外囊泡的浓度长达 7 天。9 个不同的捐赠者被吸引到 edta 和 rnac bct 中，等离子体被立即隔离（绘制时间）或 2 天、4 天和 7 天后环境条件存储。在此期间，平均整体颗粒大小保持不变（未显示数据）。（配对样品 t 检验，ns = 不显著，**= p≤0.01）。
cfrna 浓度在 rnac 中保持长达 7 天
图2。a.无细胞rna浓度在rnac中保持7天，当储存在环境温度（qubit测定，n=6健康捐赠者）。b.从单个供体中分离出的 cfrna 的生物分析器痕迹表明，在绘制到 edta bcts 的血液中，小rna物种的时间依赖性增加。 第 3 天和第 7 天 cfrna 浓度维持在接近绘制时间水平，以接近绘制到 rnac 的同一供体的时间水平。
测序库产量在 rnac out 中保存到 7 天（环境存储）
图3。a.总体测序库产量与无细胞rna的输入量直接相关。虽然无细胞rna水平随着edta样品环境条件储存时间的变化而增加，但总体库产量也增加。被吸引到 rnac bct 中的相同捐赠者保持库产量以绘制时间水平（配对样本 t 检验，ns = 不显著，**= p < 0.01，n=9 捐赠者）。b.相对测序库大小和产量为代表性的健康捐赠者（复合凝胶图像显示预期的+350nt片段大小每个库（红色箭头），这在edta增加，但保持基线水平在rnc）。c.单个库的脚本覆盖率在 edta 和 rnac 样本之间类似，并且在 7 天环境条件存储过程中不会改变。d.与编码序列对齐的映射读取与绘制到 edta bcts 的血液样本中的时间减少，并在绘制到 rnac 中的相同供体中保持不变（从 9 个供者集的平均读取数）保持不变。
rnac 中绘制时间等离子转录组维护
图4。在rnac中，大于对数2倍的基因表达变化小化 —— 只有8个基因表现出变化，而edta bcts（n=5捐赠者）中只有928个基因表现出变化。重要的是，在环境条件存储的 7 天中，非常丰富的成绩单（即规范化平均计数较高的成绩单）保持在接近基线水平。
结论streck rna 完整 bct 保持血浆细胞外囊泡的绘制时间浓度长达 7 天，当血液在环境条件下储存。从rna分离出的血浆无细胞rna完整bct可用于通用rna-seq工作流程，主要参数（转录覆盖率、映射读取、绘制时间血浆转录组）在抽血后立即与金标准edta bct不一样。rna完整bct保持cfrna的绘制时间水平，从而在血液储存环境条件下时，可获得长达7天的测序库产量。血浆转录组维持在streck rna完成bct到7天环境条件存储。更多产品信息，欢迎关注公众号：华雅思创生物
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