PCR反应的基本原理与实验步骤
一、实验目的：掌握pcr反应的基本原理与实验技术
二、pcr反应实验原理
pcr( polymerase chain reaction)-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段dna序列。其基本步骤是，首先将待扩增的模板dna变性使之成为单链，dna样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dntps和taq酶存在时，就可以合成模板dna的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使dna双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次，使所需要的dna片段得到特异性的扩增。
1. 变性：加热使模板dna在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.
2. 退火：使溶液温度降至50～60℃，模板dna与引物按碱基配对原则互补结合.
3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热dna聚合酶以单链dna为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dntps），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补dna。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的dna量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后dna可扩增106～109倍。
典型的pcr反应体系由如下组分组成：dna模板、反应缓冲液、dntps、mgcl2、两个合成的dna引物、耐热taq聚合酶。
三、 试剂和缓冲液
pcr mix，10×pcr buffer，引物，模板。
四、 仪器耗材
pcr仪，掌上离心机，微量移液器，枪头，1.5ml离心管，pcr管，冰盒。
五、 实验步骤（每人一组，每人做1管，纯化时两人一组）
1. 查找基因序列，设计合成pcr引物。注意合成引物约需一周时间，请提前准备。详细步骤请参考实验一后面的附件内容。
2. 在50μl反应体系中，加入：
模板dna (5ng/μl) 1
引物p1p2 (10μmol/l) 各1
2×pcr mix25
ddh2o 22
在冰上配制，注意混匀后离心。加入10μl石蜡油覆盖。
3. 在pcr仪中预变性94℃4min，然后循环：94℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环；循环结束后，72℃10min。扩增的pcr产物4℃保存。（oc-ii）
4.取pcr产物2-5μl与上样缓冲液混合，点样。
5. 1% 琼脂糖胶电泳，160v30-40min。
6. 电泳结束，溴化乙锭染色5-10分钟。
7. 用凝胶成像仪观察、拍照。
8. pcr产物切胶回收。步骤参见胶回收kit说明书。
a 酶切片段的纯化及其回收
使用切胶回收kit进行pcr产物的回收。具体操作步骤如下，详见说明书。
1）称回收的胶，每0.1g加100µl xp2 ；
2）55度5-7分钟至溶胶 ；
3）取溶胶液加入回收柱子，最大体积700µl；10000g, 1min；
4) 加300µl xp2 ，10000g 1min；
5）加700µl spw ，10000g 1min；
6）重复5）；
7）空管离心2min，13000 g
8）干燥，加15-30µl eulation buffer
9）13000 g，1min
dna产物纯化kit，操作步骤：
● 将pcr反应液（40ul）或酶促反应液移至一干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的buffer3，充分混匀。（用前确定加入适量的异丙醇）
●将混合液全部移入吸附柱，8000g离心30s；将滤出液再次加入到吸附柱中再次过柱，8000g离心30s（此步骤可以提高回收效率）；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。
●向吸附柱中加入500ul wash solution（加到壁上），9000g离心30s。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。（wash solution使用前请检查是否已加入正确量的无水乙醇）
●重复步骤3一次
●将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g离心1min。下管扔掉，上管放入1.5ml离心管中，晾干。（残余的乙醇会严重影响得率和后续试验）
●在吸附膜中央加入25ul 60℃提前预热（进一步提高得率）的elution buffer（加到滤芯上），室温静置1min，9000g离心1min。将所得到的dna溶液置于-20℃保存或用于后续试验。 注意：本步骤中，所有转速单位为g。
b 乙醇沉淀法
也可以使用乙醇沉淀法对pcr产物回收。具体操作步骤如下。
●加入等体积的冰无水乙醇，加入1/10体积的kac（3m ph5.2）。
●上下颠倒混匀，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。
●弃上清，加入70%的冰乙醇，轻轻混匀。12000r/min 4℃离心10min。
●弃上清，室温干燥，至无乙醇。
●加入适量体积的ddh2o。
六、注意事项
1. 进行pcr反应时，注意加入试剂的顺序。注意加入任何一种试剂后均需混匀。
2. 本实验使用2xpcr mix，包含有dntps和taq酶。
3. 引物的稀释：分子量24bp*324.5 = 7788，质量数10od*33 ＝33ug，摩尔数=33/7788 =4.2 nmol，母液浓度4.2 n mol / 84μl h2o = 50μmol/l，使用时取母液稀释5倍，则终浓度为10μmol/l。
4. pcr扩增产物共20μl，其中2-5μl用于检测，剩余的用于纯化回收。
5.使用自己的实验材料进行pcr扩增的学生，请提前准备引物和模板。
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1. 变性：加热使模板dna在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.
2. 退火：使溶液温度降至50～60℃，模板dna与引物按碱基配对原则互补结合.
3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热dna聚合酶以单链dna为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dntps），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补dna。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的dna量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后dna可扩增106～109倍。
典型的pcr反应体系由如下组分组成：dna模板、反应缓冲液、dntps、mgcl2、两个合成的dna引物、耐热taq聚合酶。
三、 试剂和缓冲液
pcr mix，10×pcr buffer，引物，模板。
四、 仪器耗材
pcr仪，掌上离心机，微量移液器，枪头，1.5ml离心管，pcr管，冰盒。
五、 实验步骤（每人一组，每人做1管，纯化时两人一组）
1. 查找基因序列，设计合成pcr引物。注意合成引物约需一周时间，请提前准备。详细步骤请参考实验一后面的附件内容。
2. 在50μl反应体系中，加入：
模板dna (5ng/μl) 1
引物p1p2 (10μmol/l) 各1
2×pcr mix25
ddh2o 22
在冰上配制，注意混匀后离心。加入10μl石蜡油覆盖。
3. 在pcr仪中预变性94℃4min，然后循环：94℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环；循环结束后，72℃10min。扩增的pcr产物4℃保存。（oc-ii）
4.取pcr产物2-5μl与上样缓冲液混合，点样。
5. 1% 琼脂糖胶电泳，160v30-40min。
6. 电泳结束，溴化乙锭染色5-10分钟。
7. 用凝胶成像仪观察、拍照。
8. pcr产物切胶回收。步骤参见胶回收kit说明书。
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1）称回收的胶，每0.1g加100µl xp2 ；
2）55度5-7分钟至溶胶 ；
3）取溶胶液加入回收柱子，最大体积700µl；10000g, 1min；
4) 加300µl xp2 ，10000g 1min；
5）加700µl spw ，10000g 1min；
6）重复5）；
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9）13000 g，1min
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3. 引物的稀释：分子量24bp*324.5 = 7788，质量数10od*33 ＝33ug，摩尔数=33/7788 =4.2 nmol，母液浓度4.2 n mol / 84μl h2o = 50μmol/l，使用时取母液稀释5倍，则终浓度为10μmol/l。
4. pcr扩增产物共20μl，其中2-5μl用于检测，剩余的用于纯化回收。
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