关于USER酶混合物的应用，看这篇就够了！
尿嘧啶特异性切除试剂（uracil-specific excision reagent , user）是由尿嘧啶dna糖基化酶（uracil dna glycosylase,udg）和核酸内切酶ⅷ(endonuclease viii, endo ⅷ)（戳链接了解详情）两种酶混合而成。udg识别ssdna或dsdna上的du碱基并形成ap位点，但磷酸二酯骨架结构保持完整。endo viii的裂解酶活性能够使ap位点的3′和5′端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖，形成单核苷酸间隙。因此，user酶混合物能在dna的du位置产生一个单核苷酸缺口，适用于ssdna、dsdna及环状dna，可应用于
rna链特异性文库构建；
尿嘧啶特异性删除介导的克隆（user-lic）；
tale基本单位的组装；
单细胞多个cdna串联建库。
图1. 切除dutp示意图
uracil-specific excision reagent的应用
01rna链特异性文库构建
rna测序（rna-seq）已成为全转录组水平研究差异基因表达和mrna差异剪接的工具，具有更准确、可重复、广泛和可靠的特点。rna-seq的基本流程包括：提取rna、建立cdna文库、上机扩增测序、数据分析。其中rna-seq文库构建包括常规建库和rna链特异性建库两种方法。在常规mrn建库的流程中，由于我们在双链cdna的两端加上的接头是对称的，这样得到的文库在测序后，无法判断测出来的reads是来自正链还是负链。为了避免普通rna-seq无法区分转录本方向的问题，后来出现了链特异的文库构建方法。链特异性rna-seq保留了转录本的方向信息，可以确定reads是来源于正链或负链，使得基因定量和可变剪切事件检测更准确。如图2所示，利用dutp标记cdna二链，user酶混合物使标记链被降解，可以实现链特异性rna-seq文库构建。
技术路线：
01使用引物合成rna对应的cdna第一链；
02使用dutp取代dttp合成cdna的第二条链；
03末端修复、3’加a、接头连接；
04去除含dutp的cdna链：用user酶混合物处理，将含有dutp的cdna链去除，留下cdna一条反链；
05pcr 扩增，上机测序。
图2.常规rna建库与链特异性文库构建对比[1]
02尿嘧啶特异性删除介导的克隆（user-lic）
user-lic是一种不依赖限制酶切位点，实现无痕克隆以及多片段同时组装的新型体外重组克隆。user-lic主要是通过user酶混合物特异性识别和删除扩增的双链dna片段中的dutp，从而实现重叠dna序列长度的可控。
技术路线：
01扩增：用含dutp的引物扩增目的片段和载体；
02切除dutp：将得到的两种线性片段用user酶混合物处理，使它们暴露互补的粘性末端；
03连接与转化：将带有互补粘性末端的两种线性片段混合后转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过筛选获得目标质粒。
图3.克隆示意图[2]
03助力tale技术，构建tale基本单位
tale技术（transcription activator-like effector , tale）是一种热门的基因编辑工具，能够精准编辑dna。tale的基本单位是一个可以识别不同碱基的蛋白domain，一个domain可以识别一个碱基，所以要构建一个识别多个连续dna碱基的tale就需要多个对应的基本蛋白domain。使用user-lic的方法，可以高效地合成这些基本单元，然后将它们有序组装成最终的tale工具。这种技术在低脱靶率等方面具有优势，被广泛用于各种基因编辑工具的开发。
技术路线：
01扩增：使用含有dutp的引物扩增每个特定的tale基本单位的编码基因；
02切除dutp：使用user酶混合物切除dutp，在每个基本单位的编码基因dna两端保留一段特定的粘性末端；
03组装：这些粘性末端按照预先设计的顺序排列，以确保所有基本单位按顺序组装连接成最终靶向特定序列的tale工具。
图4.基于尿嘧啶切除克隆的tale组装示意图[3]
04助力hit-scisoseq技术，将单细胞多个cdna串联建库
hit-scisoseq技术由华大基因唐冲博士团队和中山大学眼科中心眼科国家重点实验室刘奕志院长团队共同开发，该技术利用user酶混合物在cdna两个末端产生粘性末端，从而实现单细胞多个cdna串联建库，结合pacbio平台（ccs）测序，以实现高通量和高精度的单细胞rna亚型测序研究。
技术路线：
01获得单细胞cdna：借助10x genomics 平台，获得单细胞全长cdna；
02扩增cdna：利用生物素化的含dutp的pcr引物对全长cdna进行扩增；
03捕获cdna：然后使用链霉亲和素珠捕获扩增的生物素化的cdna；
04切除dutp：使用user酶混合物切除dutp，在cdna的两个末端产生粘性末端；
05连接与测序：使用dna连接酶连接多个cdna构建ccs文库后进行长读长测序。
图5.hit-scisoseq单细胞全长转录组数据的技术流程[4]
翌圣uracil-specific excision reagent
翌圣uracil-specific excision reagent（cat#14537es）由翌圣生物分子酶改造平台———zymeeditor™经过重组表达获得的endo viii（cat#14536es）与udg（cat#14455es）的混合酶，无核酸酶、rnase残留，低宿主残留，适用于dutp切除、user-lic、rna链特异性建库以及单细胞cdna串联建库等领域。
数据展示
01dutp切除效果与进口品牌n*一致
分别使用翌圣的uracil-specific excision reagent（1 u/μl）与进口品牌n*的同类产品（1 u/μl）切除10 pmol含dutp的双链dna，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，翌圣uracil-specific excision reagent与进口品牌n*的切除效果一致。
图6. dutp切除效果对比图
02user-lic效果优于进口品牌n*
分别使用翌圣的uracil-specific excision reagent（1 u/μl）和进口品牌n*的同类产品（1 u/μl）连接600bp dna片段构建载体，并导入到大肠杆菌中培养，观察培养皿上的菌落数，结果表明，翌圣uracil-specific excision reagent应用于user-lic效果优于进口品牌n*。
图7.菌落数对比
客户反馈
rna链特异性建库性能与进口品牌n*一致客户测试翌圣14537es与进口品牌n*的rna链特异性建库性能，扩增曲线表明翌圣uracil-specific excision reagent与进口品牌n*的rna链特异性建库性能一致。
图8.qpcr扩增曲线
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应用
产品名称
产品货号
dutp切除，user-lic，rna链特异性建库
uracil-specific excision reagent(1 u/μl)
14537es
dna损伤修复研究
endonuclease viii (10 u/μl)
14536es
pcr防污染
uracil dna glycosylase (udg/ung), 1 u/μl
14455es
参考文献
[1]zhaos,zhangy,gordonw,etal.comparisonofstrandedandnon-strandedrna-seqtranscriptomeprofilingandinvestigationofgeneoverlap.bmcgenomics.2015sep3;16(1):675.doi:10.1186/s12864-015-1876-7.[2]annalurun,mullerh,ramalingams,kandavelouk,londonv,richardsonsm,dymondjs,cooperem,baderjs,boekejd,chandrasegarans.assemblingdnafragmentsbyuserfusion.methodsmolbiol.2012;852:77-95.doi:10.1007/978-1-61779-564-0_7.pmid:22328427.[3]zhouj,wangj,chenf,zhuangz,chenm,yangy,luox,tangc,zhoux,chiy,wangj,hey,zhangk,zouq.improvedusercloningfortaleassemblyanditsapplicationtobaseediting.plosone.2023aug4;18(8):e0289509.doi:10.1371/journal.pone.0289509.[4]shi,zx.,chen,zc.,zhong,jy.etal.high-throughputandhigh-accuracysingle-cellrnaisoformanalysisusingpacbiocircularconsensussequencing.natcommun14,2631(2023).
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02使用dutp取代dttp合成cdna的第二条链；
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04去除含dutp的cdna链：用user酶混合物处理，将含有dutp的cdna链去除，留下cdna一条反链；
05pcr 扩增，上机测序。
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技术路线：
01扩增：用含dutp的引物扩增目的片段和载体；
02切除dutp：将得到的两种线性片段用user酶混合物处理，使它们暴露互补的粘性末端；
03连接与转化：将带有互补粘性末端的两种线性片段混合后转化到大肠杆菌感受态细胞中，经过筛选获得目标质粒。
图3.克隆示意图[2]
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02切除dutp：使用user酶混合物切除dutp，在每个基本单位的编码基因dna两端保留一段特定的粘性末端；
03组装：这些粘性末端按照预先设计的顺序排列，以确保所有基本单位按顺序组装连接成最终靶向特定序列的tale工具。
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03捕获cdna：然后使用链霉亲和素珠捕获扩增的生物素化的cdna；
04切除dutp：使用user酶混合物切除dutp，在cdna的两个末端产生粘性末端；
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