SN/T 1974-2007进出口水产品中亚甲基蓝残留量检测方法
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
sn/t 1974-2007
进出口水产品中亚甲基蓝残留量检测方法
液相色谱-质谱/质谱法和高效液相色谱法
determination of methylene blue residues in aquatic product for import and export-lc-ms/ms and hplc method
1范围
本标准规定了水产品中亚甲基蓝残留量测定的液相色谱质谱/质谱和高效液相色谱检测方法。
本标准适用于鱼、虾及其制品中亚甲基蓝残留的测定和确证。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3试样制备和保存
3.1试样制备
鰻鱼取连皮的鱼肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中加热30 s后连同鱼肉、虾、鳗鱼制品取所有可食部分-并放入高速组织捣碎机均质，充分混勾，装入清洁容器内，并标明标记。
制样操作过程中必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3.2试样保存
试样于-18℃以下保存。
第一法液相色谱-质谱/质谱法
4方法提要
试样中的残留物用乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取，液液分配到二氯甲烷层，中性氧化铝和阳离子固相萃取小柱净化，用串联质谱在电喷雾-选择反应监测离子的模式下，进行质谱定量和确证，外标法定量。
5试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
5.1甲酸：hplc级。
5.2甲醇：hplc级。
5.3乙腈。
5.4二氯甲烷。
5.5中性氧化铝：80目~120目。
5.6 10%甲酸甲醇溶液：量取10 ml甲酸加入90 ml甲醇中混匀。
5.7 20%二甘醇水溶液：量取200 ml二甘醇加入800 ml水中混匀。
5.8乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/l，ph=4.5)：称取8.2g无水乙酸钠溶解于1000ml水中，冰乙酸调ph到4.5。
5.9对甲苯磺酸溶液(1.0 mol/l)：称取17.2 g一水对甲苯磺酸，并用水稀释至100 ml。
5.10 30%甲醇溶液：量取30ml甲醇加入70ml水中混匀。
5.11阳离子交换萃取小柱：wcx，60 mg/3 ml或相当者。
5.12中性氧化铝萃取小柱：lc-alumina-n，500 mg/3 ml或相当者。
5. 13滤膜：0.45μm，有机相。
5.14亚甲基蓝(cas号：7220-79-3，分子式：c16h18cln4s)标准品，纯度大于等于96%。
5.15标准贮备液：准确称取适量的亚甲基蓝，用30%甲醇溶液(5.10)分别配制成100μg/ml的标准贮备液，再用该甲醇溶液(5.10)稀释配制1.0μg/ml的标准溶液，2℃~8℃避光保存。
5.16标准工作溶液：用1μg/ml的标准溶液，用30%甲醇溶液(5.10)分别稀释成200.0 ng/ml，
100.0 ng/ml，50.0 ng/ml，20.0 ng/ml，10.0 ng/ml五个浓度，现用现配。
6仪器和设备
6.1液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾(esi)源。
6.2离心机：4 000 r/min。
6.3涡旋混合器。
6.4无油真空泵。
6.5旋转蒸发仪。
6.6固相萃取装置。
6.7高速均质器。
6.8氮气吹干仪。
7测定步骤
7.1提取
称取5g均匀样品(精确到0.01g于100ml离心管中，加入5g中性氧化铝，再依次加入1.0ml
对甲苯磺酸(5.9)溶液、4.0 ml己酸钠缓冲溶段(5.8)，涡旋30 s。加入8 ml乙腈，10 00 r/min均质2min，离心5min(2000r/min，将上清液转移到50ml离心管中，，用4.0ml乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于离心管中加入8 ml二甘醇溶液(5.7)，10ml二氯甲烷，涡旋1 min，离心5 min(2000r/min)，收集下层有机层于浓缩瓶中，在40℃减压旋转蒸发至干。
7.2净化
将中性氧化铝柱串接在wcx柱上方，用3 ml乙腈活化中性氧化铝小柱和wcx萃取小柱。用6 ml乙腈分三次(每次2 ml)涡旋振荡溶解上步提取液残留物，并依次过柱，控制wcx柱上样流速约为1.0ml/min，再用2ml乙腈淋选中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3ml水、3ml乙腈淋洗wcx柱，弃去上述滤液。用4nl甲酸甲醇溶液(5.6)洗脱，洗脱流速约为1ml/min，收集洗脱液，在40℃氮气吹干，用1.0ml甲醇溶液(5.10)定容，充分振荡溶解残渣，用0.45μm滤膜过滤，待测。
7.3测定
7.3.1色谱条件
a)色谱柱：c18柱100×2.1 mm(内径)，5μm；
b)柱温：25℃；
c)进样量：25μl；
d)梯度洗脱，洗脱程序参见附录a表a.1。
7.3.2质谱条件
a)离子源：电喷雾源(esi)，正离子；
b)扫描方式：选择反应监测(srm)；
c)雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气或其他高纯气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；条件参见附录b表b.1；
d)喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最（zui）优灵敏度。
7.3.3色谱测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，标准工作液应有五个浓度水平，应包括零点。标准工作液和待测样液中亚甲基蓝的响应值均应在仪器线性响应范围内。上述色谱条件下，亚甲基蓝药物的保留时间为4.6min、母离子和子离子参见附录b表b.2。标准品总离子流图参见附录c图c.1。
7.3.4定性测定
进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表1中规定的范围，则可判断祥品中存在对应的被测物。
7.3.5空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
8结果计算和表述
用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式(1)计算试样中亚甲基蓝药物的残留量：
式中：
x——试样中亚甲基蓝药物残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
v——样品最终定容体积单位为毫升(ml)；
c——由标准曲线而得的样液中亚甲基蓝药物的含量，单位为微克每升(μg/l)；
c0——由标准曲线而得的空白实验中亚甲基蓝药物的含量，单位为微克每升(μg/l)；
m——试样量，单位为克g。
9测定低限与回收率
9.1测定低限
本方法的测定低限为：0.005mg/kg。
9.2回收率
——在添加浓度为0.005mg/kg时，回收率为74.0%~100.4%；
——在添加浓度为0.010mg/kg时，回收率为77.4%~96.8%；
——在添加浓度为0.040mg/kg时，回收率为75.2%~102.0%。
第二法高效液相色谱法
10方法提要
试样中的残留物用乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取后，液液分配到二氯甲烷层，中性氧化铝和阳离子固相萃取小柱净化，用配有紫外-可见检测器的高效液相色谱仪检测，外标法定量。
11试剂和材料
同第5章。
12仪器和设备
12. 1高效液相色谱仪，配有紫外-可见光检测器。
12.2其余同第6章。
13测定步骤
13. 1提取
同7.1。
13.2净化
同7.2。
13.3测定
13.3.1液相色谱条件
a)色谱柱：c18柱150×2.1 mm(内径)，5μm；
b)柱温：25℃；
c)梯度洗脱，洗脱程序参见附录a表a.2；
d)检测波长：655 nm；
e)进样量：50μl。
13.3.2色谱测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，标准工作液应有五个浓度水平，应包括零点。标准工作液和待测样液中亚甲基蓝的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下，亚甲基蓝的保留时间约为7.2min，标准品色谱图参见附录c中图c.2。
13.4空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
14结果计算和表述
同第8章。
15测定低限、回收率
15.1测定低限
本方法的测定低限为：0.005 mg/kg。
15.2回收率
——在添加浓度为0.005 mg/kg时，回收率为74.2%~ 100.0%；
——在添加浓度为0.010 mg/kg时，回收率为73.0%~ 104.7%；
——在添加浓度为0.040 mg/kg时，回收率为77.8%~ 108.3%。
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1范围
本标准规定了水产品中亚甲基蓝残留量测定的液相色谱质谱/质谱和高效液相色谱检测方法。
本标准适用于鱼、虾及其制品中亚甲基蓝残留的测定和确证。
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下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
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3试样制备和保存
3.1试样制备
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3.2试样保存
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4方法提要
试样中的残留物用乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取，液液分配到二氯甲烷层，中性氧化铝和阳离子固相萃取小柱净化，用串联质谱在电喷雾-选择反应监测离子的模式下，进行质谱定量和确证，外标法定量。
5试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
5.1甲酸：hplc级。
5.2甲醇：hplc级。
5.3乙腈。
5.4二氯甲烷。
5.5中性氧化铝：80目~120目。
5.6 10%甲酸甲醇溶液：量取10 ml甲酸加入90 ml甲醇中混匀。
5.7 20%二甘醇水溶液：量取200 ml二甘醇加入800 ml水中混匀。
5.8乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/l，ph=4.5)：称取8.2g无水乙酸钠溶解于1000ml水中，冰乙酸调ph到4.5。
5.9对甲苯磺酸溶液(1.0 mol/l)：称取17.2 g一水对甲苯磺酸，并用水稀释至100 ml。
5.10 30%甲醇溶液：量取30ml甲醇加入70ml水中混匀。
5.11阳离子交换萃取小柱：wcx，60 mg/3 ml或相当者。
5.12中性氧化铝萃取小柱：lc-alumina-n，500 mg/3 ml或相当者。
5. 13滤膜：0.45μm，有机相。
5.14亚甲基蓝(cas号：7220-79-3，分子式：c16h18cln4s)标准品，纯度大于等于96%。
5.15标准贮备液：准确称取适量的亚甲基蓝，用30%甲醇溶液(5.10)分别配制成100μg/ml的标准贮备液，再用该甲醇溶液(5.10)稀释配制1.0μg/ml的标准溶液，2℃~8℃避光保存。
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6仪器和设备
6.1液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾(esi)源。
6.2离心机：4 000 r/min。
6.3涡旋混合器。
6.4无油真空泵。
6.5旋转蒸发仪。
6.6固相萃取装置。
6.7高速均质器。
6.8氮气吹干仪。
7测定步骤
7.1提取
称取5g均匀样品(精确到0.01g于100ml离心管中，加入5g中性氧化铝，再依次加入1.0ml
对甲苯磺酸(5.9)溶液、4.0 ml己酸钠缓冲溶段(5.8)，涡旋30 s。加入8 ml乙腈，10 00 r/min均质2min，离心5min(2000r/min，将上清液转移到50ml离心管中，，用4.0ml乙腈重复提取残渣一次，合并上清液。于离心管中加入8 ml二甘醇溶液(5.7)，10ml二氯甲烷，涡旋1 min，离心5 min(2000r/min)，收集下层有机层于浓缩瓶中，在40℃减压旋转蒸发至干。
7.2净化
将中性氧化铝柱串接在wcx柱上方，用3 ml乙腈活化中性氧化铝小柱和wcx萃取小柱。用6 ml乙腈分三次(每次2 ml)涡旋振荡溶解上步提取液残留物，并依次过柱，控制wcx柱上样流速约为1.0ml/min，再用2ml乙腈淋选中性氧化铝柱后，弃去中性氧化铝柱。依次用3ml水、3ml乙腈淋洗wcx柱，弃去上述滤液。用4nl甲酸甲醇溶液(5.6)洗脱，洗脱流速约为1ml/min，收集洗脱液，在40℃氮气吹干，用1.0ml甲醇溶液(5.10)定容，充分振荡溶解残渣，用0.45μm滤膜过滤，待测。
7.3测定
7.3.1色谱条件
a)色谱柱：c18柱100×2.1 mm(内径)，5μm；
b)柱温：25℃；
c)进样量：25μl；
d)梯度洗脱，洗脱程序参见附录a表a.1。
7.3.2质谱条件
a)离子源：电喷雾源(esi)，正离子；
b)扫描方式：选择反应监测(srm)；
c)雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气或其他高纯气体；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；条件参见附录b表b.1；
d)喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最（zui）优灵敏度。
7.3.3色谱测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，标准工作液应有五个浓度水平，应包括零点。标准工作液和待测样液中亚甲基蓝的响应值均应在仪器线性响应范围内。上述色谱条件下，亚甲基蓝药物的保留时间为4.6min、母离子和子离子参见附录b表b.2。标准品总离子流图参见附录c图c.1。
7.3.4定性测定
进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表1中规定的范围，则可判断祥品中存在对应的被测物。
7.3.5空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
8结果计算和表述
用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式(1)计算试样中亚甲基蓝药物的残留量：
式中：
x——试样中亚甲基蓝药物残留量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
v——样品最终定容体积单位为毫升(ml)；
c——由标准曲线而得的样液中亚甲基蓝药物的含量，单位为微克每升(μg/l)；
c0——由标准曲线而得的空白实验中亚甲基蓝药物的含量，单位为微克每升(μg/l)；
m——试样量，单位为克g。
9测定低限与回收率
9.1测定低限
本方法的测定低限为：0.005mg/kg。
9.2回收率
——在添加浓度为0.005mg/kg时，回收率为74.0%~100.4%；
——在添加浓度为0.010mg/kg时，回收率为77.4%~96.8%；
——在添加浓度为0.040mg/kg时，回收率为75.2%~102.0%。
第二法高效液相色谱法
10方法提要
试样中的残留物用乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取后，液液分配到二氯甲烷层，中性氧化铝和阳离子固相萃取小柱净化，用配有紫外-可见检测器的高效液相色谱仪检测，外标法定量。
11试剂和材料
同第5章。
12仪器和设备
12. 1高效液相色谱仪，配有紫外-可见光检测器。
12.2其余同第6章。
13测定步骤
13. 1提取
同7.1。
13.2净化
同7.2。
13.3测定
13.3.1液相色谱条件
a)色谱柱：c18柱150×2.1 mm(内径)，5μm；
b)柱温：25℃；
c)梯度洗脱，洗脱程序参见附录a表a.2；
d)检测波长：655 nm；
e)进样量：50μl。
13.3.2色谱测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，标准工作液应有五个浓度水平，应包括零点。标准工作液和待测样液中亚甲基蓝的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下，亚甲基蓝的保留时间约为7.2min，标准品色谱图参见附录c中图c.2。
13.4空白实验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
14结果计算和表述
同第8章。
15测定低限、回收率
15.1测定低限
本方法的测定低限为：0.005 mg/kg。
15.2回收率
——在添加浓度为0.005 mg/kg时，回收率为74.2%~ 100.0%；
——在添加浓度为0.010 mg/kg时，回收率为73.0%~ 104.7%；
——在添加浓度为0.040 mg/kg时，回收率为77.8%~ 108.3%。
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