常见的PCR反应抑制物一览
常见的pcr反应抑制物一览
一个pcr反应过程分为很多的步骤，同时也受到很多因素的影响，可以分为内部因素和外部因素，内部因素是指正常试剂体系中的成分，外部因素是指环境或者样本带入的因素。
体系内部因素
引物：引物是整个pcr体系最重要的部分，也是决定一个pcr反应特异性的关键，引物在设计时要遵守一定的原则（长度、扩增跨度、碱基等）。
酶及其浓度：目前有两种taq dna聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶，酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dntp的质量与浓度：dntp溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dntp的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会引起pcr产物的产量。
模板核酸（靶标）：模板核酸的量和纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一，对于rna模板更要注意rna的降解。
mg2+浓度：主要影响pcr扩增的特异性和产量，一般要对应dntp的浓度。mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少。
温度与时间的设置：pcr原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点，也就是变性温度与时间、退火（复性）温度与时间、延伸温度与时间。
循环次数：循环次数决定pcr扩增程度，pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量就越多。
其他抑制剂
除上述抑制剂外，还存在一定的pcr增强剂，比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、peg、亚精胺和单链dna结合蛋白等，但是在高浓度情况下，也会对pcr产生抑制，因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响，采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。
临床pcr常见问题
1假阳性问题
方法学问题：靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增
污染问题：样本污染、产物污染、产物污染
解决办法：严格区分试验区域及人员培训，使用ung技术
2假阴性问题
问题来源：试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素
解决办法：
设置阳性对照监测试剂问题
降低操作难度，提高操作人员水平
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体系内部因素
引物：引物是整个pcr体系最重要的部分，也是决定一个pcr反应特异性的关键，引物在设计时要遵守一定的原则（长度、扩增跨度、碱基等）。
酶及其浓度：目前有两种taq dna聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶，酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dntp的质量与浓度：dntp溶液呈酸性，一般配置成体系需将其调节至7.0-7.5，正常情况下4种dntp的浓度应该相等，如果其中某一种过高就会引起错配，浓度过低又会引起pcr产物的产量。
模板核酸（靶标）：模板核酸的量和纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一，对于rna模板更要注意rna的降解。
mg2+浓度：主要影响pcr扩增的特异性和产量，一般要对应dntp的浓度。mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少。
温度与时间的设置：pcr原理三步骤涉及变性-退火-延伸三个温度点，也就是变性温度与时间、退火（复性）温度与时间、延伸温度与时间。
循环次数：循环次数决定pcr扩增程度，pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度。一般温度循环次数在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量就越多。
其他抑制剂
除上述抑制剂外，还存在一定的pcr增强剂，比如甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、peg、亚精胺和单链dna结合蛋白等，但是在高浓度情况下，也会对pcr产生抑制，因此如何采用增强剂消除抑制剂的影响，采用多少的浓度对结果都存在很大的影响。
临床pcr常见问题
1假阳性问题
方法学问题：靶基因序列特异性、引物错配、非特异性扩增
污染问题：样本污染、产物污染、产物污染
解决办法：严格区分试验区域及人员培训，使用ung技术
2假阴性问题
问题来源：试剂因素、操作因素、仪器因素、标本因素
解决办法：
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