PCR反应循环步骤介绍
pcr（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增dna片段。它利用dna聚合酶在模板dna上的反复扩增（涉及到三个步骤：变性、退火和延伸）来实现短时间内产生大量特定的dna序列。pcr技术已经被广泛用于基因检测、病毒检测、dna测序等领域。
在变性步骤中，模板dna被加热以使其变性，即将其双链dna分离成两条单链dna。在退火步骤中，引物与模板dna结合形成一个双链dna结构。在延伸步骤中，聚合酶沿着模板dna链合成新的单链dna，从而扩增特定的dna片段。
pcr需要经过以下循环：
1.初始化步骤。这仅对热启动 pcr 不可少。此步骤将溶液加热至 94-98°c，以激活 dna 聚合酶。该步骤的时间取决于所使用的聚合酶。
2.变性步骤。dna是双链分子，dna扩增需要引物与单链dna模板相互作用。在此步骤中，将反应混合物加热至 94-98°c 并保持 20-30 秒，以破坏两条链之间的氢键并生成单链 dna 分子。此时进入 pcr 循环。
3.退火步骤。变性后，反应混合物中的 dna 模板是单链的。由于引物与dna模板互补，当反应温度降低到50-65℃时，引物会与模板序列匹配，互补碱基之间形成氢键。退火温度取决于所用引物的tm，一般比引物tm低3-5℃左右。该步骤将持续约 20-40 秒以全退火，然后聚合酶将定位到引物-模板杂交体以开始 dna 组装。
4.伸长步骤。在此步骤中，dna 聚合酶开始合成 dna，因此温度应为 dna 聚合酶的最适温度。一般选择 72°c，但有些酶在 68°c 时效果更好。这一步与体内dna复制非常相似，dna聚合酶将dntps添加到引物中，以5'到3'方向与模板互补，最终产生新的双链dna片段。延伸时间取决于目标 dna 片段的长度和 dna 聚合酶的能力。一般来说，dna 聚合酶每 60 秒产生一千个碱基。
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