7种细胞凋亡有效的检测方法
7种细胞凋亡有效的检测方法
一、细胞凋亡的形态学检测
根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1 光学显微镜和倒置显微镜
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
3 透射电子显微镜观察
二、磷脂酰*外翻分析（annexin v法）
磷脂酰*（phosphatidylserine, ps）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，ps可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。annexin-v是一种分子量为35~36kd的ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与ps高亲和力特异性结合。将annexin-v进行荧光素（fitc、pe）或biotin标记，以标记了的annexin-v作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, pi)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，pi能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将annexin-v与pi匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
三、线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、dna断裂）出现之前，一旦线粒体dymt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。
线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如rhodamine 123、3，3-dihexyloxacarbocyanine iodide[dioc6（3）]、tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[jc-1]、tetramethyl rhodamine methyl ester(tmrm)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
四、dna的片断化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质dna在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的dna大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(dna ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯dna，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的dna ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯dna后，用32p-atp和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt）使dna标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中dna ladder的形成。
1.大分子染色体dna的片段的测定
2.dna ladder 测定
3.凋亡细胞dna含量的流式细胞计分析
五、tunel法
细胞凋亡中, 染色体dna双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-oh末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或*形成的衍生物标记到dna的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, tunel）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有dna的断裂，因而没有3'-oh形成，很少能够被染色。tunel实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
六、caspase-3活性的检测
caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。caspase-3正常以酶原（32kd）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基（17kd）和两个小亚基（12kd）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
七、凋亡相关蛋白tfar19蛋白的表达和细胞定位分析
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3 透射电子显微镜观察
二、磷脂酰*外翻分析（annexin v法）
磷脂酰*（phosphatidylserine, ps）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，ps可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。annexin-v是一种分子量为35~36kd的ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与ps高亲和力特异性结合。将annexin-v进行荧光素（fitc、pe）或biotin标记，以标记了的annexin-v作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
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三、线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、dna断裂）出现之前，一旦线粒体dymt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。
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四、dna的片断化检测
细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质dna在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的dna大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(dna ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯dna，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的dna ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯dna后，用32p-atp和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt）使dna标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中dna ladder的形成。
1.大分子染色体dna的片段的测定
2.dna ladder 测定
3.凋亡细胞dna含量的流式细胞计分析
五、tunel法
细胞凋亡中, 染色体dna双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-oh末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（tdt）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或*形成的衍生物标记到dna的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, tunel）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有dna的断裂，因而没有3'-oh形成，很少能够被染色。tunel实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
六、caspase-3活性的检测
caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。caspase-3正常以酶原（32kd）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的caspase-3由两个大亚基（17kd）和两个小亚基（12kd）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
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