细胞免疫荧光实验的方法、步骤有哪些？
细胞免疫荧光主要应用于细胞内抗原抗体检测，适用于细胞水平实验。那么细胞免疫荧光有哪些方法和步骤呢？让我们一起来看看吧！
一、直接法
将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
二、间接法（较为常用）
如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
三、操作步骤
1.倒出培养液。
2.润洗，将1ml sdwan全培养基沿培养板缓慢打入，盖上盖子，轻柔摇晃，先使用1ml的枪沿侧壁吸出润洗后，再使用200ul的枪沿壁吸出残液。
3.吹打，加入2ml sdwan全培养基，打在培养板底部，然后反复抽打，直至培养板底部由磨玻璃样变为透明。（吹打之后放置，后使用之前都要反复吹打）
4.将细胞爬片放入24孔板，每孔一个（注意每个孔只放一个，不要多放，注意检查）。
5.往（3）中吹打后的细胞液中继续加4ml的sdwan全培养基（即总计6ml）。将细胞液分装到24孔板中（分装之前吹打，防止细胞沉降而造成的不均匀），每个板500ul。注意事项：每一步打开细胞培养时，防止细胞培养板盖时勿使细胞培养板盖朝上放置。
6.在将细胞培养板放于培养箱之前，请喷酒精。
7.细胞培养24小时之内使用，最好20小时。沿侧壁吸出培养液。1pbs润洗2次，沿侧壁打入1ml或500ul pbs，轻柔摇匀2-3次后，沿侧壁吸出。
8.pfu number/细胞数=pfuv/细胞数=感染复数 感染复数为2，加病毒20ul + 480ul sd培养液 感染复数为15，加病毒150ul + 480ul sd培养液 病毒滴数经提前测定为1*10-7pfu/ml
9.先加sd培养基再加病毒。（24h或48h之后进行（10））
10固定细胞：吸出上清，加4%pfa（组织固定液），1ml/孔，室温下30min。
11.pbs洗2次，5min/次，1ml/孔。
12.细胞破膜：0.1% triton in pbs(pbst,t为triton) ，pbs：triton=1l：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室温1h。
13.封闭：5% bsa in pbst（t:0.5%tween）=bsa + pbst (100ml pbst 中添加5g bsa ) pbst=pbs+tween(1l pbs中添加500ultween) bsa 为牛血清白蛋白。1ml/孔，室温下2h。
14.一抗：用封闭液按1：100（比例依照抗体说明书）稀释，300ul/孔，4摄氏度过夜。
15.pbst（tween）洗3次，10min/次 。
16.二抗（4℃抗体荧光抗体）：用pbst（tween）按1：1000稀释，300ul/孔，室温避光1h。
17.pbst（tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） dpai ，300ul/孔，室温避光10分钟。
18.pbs 洗2次，1ml/孔，立马抽出。
19.载玻片上滴加封片液，细胞爬片的细胞层与封片液接触。
20.荧光共聚焦显微镜观察。
更多有关细胞免疫荧光实验方法和步骤问题，请联系北京百奥创新科技有限公司：
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二、间接法（较为常用）
如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
三、操作步骤
1.倒出培养液。
2.润洗，将1ml sdwan全培养基沿培养板缓慢打入，盖上盖子，轻柔摇晃，先使用1ml的枪沿侧壁吸出润洗后，再使用200ul的枪沿壁吸出残液。
3.吹打，加入2ml sdwan全培养基，打在培养板底部，然后反复抽打，直至培养板底部由磨玻璃样变为透明。（吹打之后放置，后使用之前都要反复吹打）
4.将细胞爬片放入24孔板，每孔一个（注意每个孔只放一个，不要多放，注意检查）。
5.往（3）中吹打后的细胞液中继续加4ml的sdwan全培养基（即总计6ml）。将细胞液分装到24孔板中（分装之前吹打，防止细胞沉降而造成的不均匀），每个板500ul。注意事项：每一步打开细胞培养时，防止细胞培养板盖时勿使细胞培养板盖朝上放置。
6.在将细胞培养板放于培养箱之前，请喷酒精。
7.细胞培养24小时之内使用，最好20小时。沿侧壁吸出培养液。1pbs润洗2次，沿侧壁打入1ml或500ul pbs，轻柔摇匀2-3次后，沿侧壁吸出。
8.pfu number/细胞数=pfuv/细胞数=感染复数 感染复数为2，加病毒20ul + 480ul sd培养液 感染复数为15，加病毒150ul + 480ul sd培养液 病毒滴数经提前测定为1*10-7pfu/ml
9.先加sd培养基再加病毒。（24h或48h之后进行（10））
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11.pbs洗2次，5min/次，1ml/孔。
12.细胞破膜：0.1% triton in pbs(pbst,t为triton) ，pbs：triton=1l：1ml或100ml:0.1ml。1ml/孔，室温1h。
13.封闭：5% bsa in pbst（t:0.5%tween）=bsa + pbst (100ml pbst 中添加5g bsa ) pbst=pbs+tween(1l pbs中添加500ultween) bsa 为牛血清白蛋白。1ml/孔，室温下2h。
14.一抗：用封闭液按1：100（比例依照抗体说明书）稀释，300ul/孔，4摄氏度过夜。
15.pbst（tween）洗3次，10min/次 。
16.二抗（4℃抗体荧光抗体）：用pbst（tween）按1：1000稀释，300ul/孔，室温避光1h。
17.pbst（tween）洗3次，1ml/孔，10min/次。（18） dpai ，300ul/孔，室温避光10分钟。
18.pbs 洗2次，1ml/孔，立马抽出。
19.载玻片上滴加封片液，细胞爬片的细胞层与封片液接触。
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