分子垂钓最怕非特异性和低亲和力？Octet来救场！
适配子（aptamer）是对某个靶点分子有特异结合的dna或rna寡核苷酸，因其分子识别能力在诊断和治疗应用中具有巨大的潜力。然而，高亲和力和高特异性的核酸适配子往往不容易获得。适配子一般是通过selex方法从核酸库中进行筛选，这个方法依赖于将靶点分子固定在某个固相，再去钓取潜在与靶点结合的适配子，但是固化有可能导致的空间位阻限制了靶点和适配子结合的自由度。
背景与实验设计
近期的一篇文章中，四川大学生命科学学院黄震组先将靶点生物素化，然后将生物素靶点（hpv l1蛋白）和适配子在液相中混合形成适配子-靶点复合物，再用偶联链霉亲和素的固相介质（包括磁珠和octet® 传感器）去抓取这种复合物，并进行洗脱鉴定，这样便成功克服了先固化靶点所带来的不利影响，使得适配体的筛选效率显著提升，该方法被称之为 free aptamer-ligand interaction (frari)[1]。
图1. frari示意图：通过多轮frari循环，富集和筛选到高亲和力的适配子
本篇文章在筛选适配子过程中做了2个不同维度的比较：
1
selex, octet® (bli法，生物层干涉), 和mb (磁珠法)三种方法的比较；
2
随机生物素化靶点和定点生物素化靶点的比较：前者通过靶点蛋白的氨基随机共价偶联生物素，后者通过avi tag在n端进行定点生物素化，原则上后者可以更好地保持靶点的天然结构。
octet® 的实验方法与结果
将生物素化靶点和dna文库室温下孵育1小时。然后，使用octet® 的sa传感器与混合物孵育50分钟来捕获形成的复合物。用pbs洗涤两次（一次600秒，一次120秒）后，将捕获的复合物传感器用蛋白酶k（1.8μl，20mg/ml）52°c中消化2小时。接下来，扩增、制备次轮文库，进行多轮筛选后测序鉴定。
a
c
b
图2. selex, mb, octet® 三种方法比较（定点生物素化法）：selex 九轮富集的特异适配子丰度（a）远远低于frari方法，包括bli（b）和mb（c）
对比发现，octet® 法和mb法在进行6轮筛选后便能富集获得特异性适配子，而在经过9轮筛选后，octet® 法和mb法均实现了高丰度的特异性适配子富集。并且基于frari的octet® 法筛选出的几个高亲和力适配子与基于mb法筛选的结果是一致的。更关键的是，octet® 法丰度的区分度更好，比如最高丰度的一个适配子（蓝色）占绝大多数，随后的实验也证实该适配子具有更强的亲和力，说明octet® 可以更好地区分特异性适配子的亲和力。
方法验证
octet® 筛选出的丰度较好的适配子（s4）亲和力是否更强呢？作者将生物素化的适配子固化在链霉亲和素（sa）传感器上，与靶点蛋白进行结合解离，以计算结合动力学参数。
图3. octet® 法筛选出的适配子与靶点亲和力，可见s4的亲和力最高，kd值达到几十nm
随后作者使用octet® 法筛选的适配子成功建立了基于夹心法的hpv临床诊断方法，实现了临床样品中hpv的检测，进一步证明这些适配子的强亲和力和特异性。
octet® 传感器不仅适合frari法，而且相对mb法，octet® 可以排除许多低亲和力适配子，这可能是因为bli传感器具有较少的表面积和非特异性结合。因此，octet® 为核酸适配体的选择提供了高效率的筛选方法。
最近广西大学发表的一篇文章中，开发了一种便携式、独立的核酸适配子传感器用于检测蝗虫信息素4-乙烯基苯甲醚（4va），以监测蝗虫种群动态，实现蝗灾预警。使用octet® 的垂钓方法获得了针对4va的kd值为269.25±90.65nm的高亲和力适配子，并用此来建立传感器检测方法。
图4. 使用octet® 传感器固化4-乙烯基苯甲醚（4va），结合适配子库，然后用不同强度方法洗脱与4va结合的适配子
表1. octet® 筛选的适配子用octet®进行亲和力测定
octet® 不仅可以用于垂钓，也可以用于亲和力的验证哦！
octet® 用于亲和力验证的优点在于：
非标记direct binding是趋势，不需要标记和信号放大，可以更好地保持反应物的活性
快速测定亲和力，提供结合速率常数和解离速率常数更加定量化地表征分子互作
无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）
写入了美国药典，文章多，认可度广
万金油技术，可以用与检测dna，小分子，蛋白质等各种生物分子
操作简便，耗材及维护成本低
大家大胆地使用垂钓神器 octet® 非标记分子互作系统去发现未知世界吧！
《生物层干涉技术应用文集第三版》
全新改版！
下载文档
下载《生物层干涉技术应用文集（第三版）》，查看更多更全面的bli技术原理、应用展示
-参考文献-
【1】highly-efficient selection of aptamers for detecting various hpv subtypes in clinical samples.talanta 2023.
【2】development of functional nucleic acid sensor for detection of locust pheromone 4-vinylanisole.chemical engineering journal 466 (2023) 143065
板框压滤机停电会受到哪些影响
进口Sicme Motori电机技术参数规格特点
加药装置的使用说明及注意事项
FIP手动隔膜阀工作原理及使用说明
真空应用于哪些行业？
分子垂钓最怕非特异性和低亲和力？Octet来救场！
OMAL天然气执行器SR360401S|OMAL报关
不同类型的培养基制备过程中常用的8个一般步骤
倍加福移动机械设备
2205双相不锈钢法兰式球阀在海洋工程应用
食品包装机更换油的时候需要注意哪些事情？
从运输到操作，会影响纯化水设备效果的几个重点
BAUBLIES辊针 S2714 技术参数
聚氨酯热水保温管的主要优点
3C行业是移动机器人在工业搬运场景中的爆发点
选择合适的羽绒枕充填填充物
高精度灌装系统的适用及应用特性
写真化学Kakuhunter与其他搅拌消泡方法的比较
安装沙场泥浆污水处理要满足哪些要求
串联谐振耐压测试装置有什么优点？
背景与实验设计
近期的一篇文章中，四川大学生命科学学院黄震组先将靶点生物素化，然后将生物素靶点（hpv l1蛋白）和适配子在液相中混合形成适配子-靶点复合物，再用偶联链霉亲和素的固相介质（包括磁珠和octet® 传感器）去抓取这种复合物，并进行洗脱鉴定，这样便成功克服了先固化靶点所带来的不利影响，使得适配体的筛选效率显著提升，该方法被称之为 free aptamer-ligand interaction (frari)[1]。
图1. frari示意图：通过多轮frari循环，富集和筛选到高亲和力的适配子
本篇文章在筛选适配子过程中做了2个不同维度的比较：
1
selex, octet® (bli法，生物层干涉), 和mb (磁珠法)三种方法的比较；
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随机生物素化靶点和定点生物素化靶点的比较：前者通过靶点蛋白的氨基随机共价偶联生物素，后者通过avi tag在n端进行定点生物素化，原则上后者可以更好地保持靶点的天然结构。
octet® 的实验方法与结果
将生物素化靶点和dna文库室温下孵育1小时。然后，使用octet® 的sa传感器与混合物孵育50分钟来捕获形成的复合物。用pbs洗涤两次（一次600秒，一次120秒）后，将捕获的复合物传感器用蛋白酶k（1.8μl，20mg/ml）52°c中消化2小时。接下来，扩增、制备次轮文库，进行多轮筛选后测序鉴定。
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图2. selex, mb, octet® 三种方法比较（定点生物素化法）：selex 九轮富集的特异适配子丰度（a）远远低于frari方法，包括bli（b）和mb（c）
对比发现，octet® 法和mb法在进行6轮筛选后便能富集获得特异性适配子，而在经过9轮筛选后，octet® 法和mb法均实现了高丰度的特异性适配子富集。并且基于frari的octet® 法筛选出的几个高亲和力适配子与基于mb法筛选的结果是一致的。更关键的是，octet® 法丰度的区分度更好，比如最高丰度的一个适配子（蓝色）占绝大多数，随后的实验也证实该适配子具有更强的亲和力，说明octet® 可以更好地区分特异性适配子的亲和力。
方法验证
octet® 筛选出的丰度较好的适配子（s4）亲和力是否更强呢？作者将生物素化的适配子固化在链霉亲和素（sa）传感器上，与靶点蛋白进行结合解离，以计算结合动力学参数。
图3. octet® 法筛选出的适配子与靶点亲和力，可见s4的亲和力最高，kd值达到几十nm
随后作者使用octet® 法筛选的适配子成功建立了基于夹心法的hpv临床诊断方法，实现了临床样品中hpv的检测，进一步证明这些适配子的强亲和力和特异性。
octet® 传感器不仅适合frari法，而且相对mb法，octet® 可以排除许多低亲和力适配子，这可能是因为bli传感器具有较少的表面积和非特异性结合。因此，octet® 为核酸适配体的选择提供了高效率的筛选方法。
最近广西大学发表的一篇文章中，开发了一种便携式、独立的核酸适配子传感器用于检测蝗虫信息素4-乙烯基苯甲醚（4va），以监测蝗虫种群动态，实现蝗灾预警。使用octet® 的垂钓方法获得了针对4va的kd值为269.25±90.65nm的高亲和力适配子，并用此来建立传感器检测方法。
图4. 使用octet® 传感器固化4-乙烯基苯甲醚（4va），结合适配子库，然后用不同强度方法洗脱与4va结合的适配子
表1. octet® 筛选的适配子用octet®进行亲和力测定
octet® 不仅可以用于垂钓，也可以用于亲和力的验证哦！
octet® 用于亲和力验证的优点在于：
非标记direct binding是趋势，不需要标记和信号放大，可以更好地保持反应物的活性
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无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快）
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