免疫沉淀的关键影响因素
每种免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序，但都是以抗原-抗体特异性结合为基础。目前常规操作是利用共价结合蛋白a或蛋白g的琼脂糖或磁性微球将反应后的抗原-抗体复合物富集纯化。
蛋白a和蛋白g能特异地和抗体的保守区fc段结合，形成稳定的抗原-抗体复合物附着在微球上，溶液内无关的分子可以通过洗涤微球被清除，后，再采用一系列方法分析纯化抗原或与抗原结合的其他分子。整个过程中值得注意的几个关键影响因素如下：
1、样品处理的质量
免疫沉淀实验成功的关键在于步样品处理。免疫沉淀实验本质是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中抗原的质量，如抗原的丰度及抗原的构象状态。
样品处理应根据抗原样品的来源如组织样品、细胞或其他形式的样品，选择适当的方式进行细胞或组织破碎，使待检抗原释放至样品溶液中。裂解缓冲液的使用应注意添加合适的蛋白酶抑制，避免抗原或抗原-其他分子复合物被降解，另外，应选用去垢剂强度合适的裂解液，既保证有效裂解细胞释放抗原又不破坏蛋白质之间的相互作用。
2、抗体的选择
在考虑抗体特异性的同时，还需考虑抗体对抗原的亲和力，如单克隆抗体只对抗原的单一表位具有良好的特异性，因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分，受到破坏，或受其他因素影响，造成抗体不能识别抗原，无法有效形成免疫沉淀复合物，那么这将直接影响免疫沉淀的结果。而多克隆抗体或混合单克隆抗体可以和抗原的多个表位结合，从而解决亲和力的问题。但是，并不是所有抗体都能用于免疫沉淀，应选用经ip实验验证后的抗体以确保实验结果的可靠性。此外，不同类型、同类不同亚型的抗体对蛋白 a或g的亲和力不同，应选择合适的抗体及微球用于免疫沉淀。
3、微球的选择
目前广泛应用于免疫沉淀的微球以结合了蛋白 a或g的琼脂糖和磁性微球为主。琼脂糖材料是无色透明、粒径达微米级的具有多孔表面的微球，有巨大的表面积，蛋白结合量高，曾一度成为免疫沉淀技术中的主要材料。但在免疫沉淀操作中需要采用离心的方法达到固液分离，而反复离心产生的物理应力极易破坏蛋白的天然构象及完整性，且由于琼脂糖本身容易破碎，不易保存，限制了琼脂糖微球在免疫沉淀中的发展。
相比之下，磁性微球其核心为超顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子材料，表面平滑，粒径可达纳米级，比表面积大，单位重量的微球蛋白结合量更大。超顺磁性微球可以在外加磁场中表现磁性，实现快速有效分离，大大缩短实验操作时间。温和的磁性分离方式避免反复离心对蛋白天然构象及完整性的破坏。超顺磁性微球在增大机械强度和稳定性的同时，缩减了产品造价。上述的优势使超顺磁性微球成为免疫沉淀试剂盒行业的新秀，逐渐被研究者所采用。
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2、抗体的选择
在考虑抗体特异性的同时，还需考虑抗体对抗原的亲和力，如单克隆抗体只对抗原的单一表位具有良好的特异性，因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分，受到破坏，或受其他因素影响，造成抗体不能识别抗原，无法有效形成免疫沉淀复合物，那么这将直接影响免疫沉淀的结果。而多克隆抗体或混合单克隆抗体可以和抗原的多个表位结合，从而解决亲和力的问题。但是，并不是所有抗体都能用于免疫沉淀，应选用经ip实验验证后的抗体以确保实验结果的可靠性。此外，不同类型、同类不同亚型的抗体对蛋白 a或g的亲和力不同，应选择合适的抗体及微球用于免疫沉淀。
3、微球的选择
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相比之下，磁性微球其核心为超顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子材料，表面平滑，粒径可达纳米级，比表面积大，单位重量的微球蛋白结合量更大。超顺磁性微球可以在外加磁场中表现磁性，实现快速有效分离，大大缩短实验操作时间。温和的磁性分离方式避免反复离心对蛋白天然构象及完整性的破坏。超顺磁性微球在增大机械强度和稳定性的同时，缩减了产品造价。上述的优势使超顺磁性微球成为免疫沉淀试剂盒行业的新秀，逐渐被研究者所采用。
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