NEXSTAR微流控制备仪LNP包裹方案
制备dlin-mc3脂质纳米颗粒
实验目的：
分别以dlin-mc3为阳离子主要脂质，参照文献方法制备包载mrna的lnp。
实验原理：
dlin-mc3是可解离脂质，在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质，通过静电作用于带负电的mrna结合，形成载有mrna的脂质纳米颗粒(lipidnanoparticles,lnps)。常见的制备方法有薄膜-水化法、溶剂注入法、高压均质法和微流控法等方法，在本实验中采用微流控法，让脂质溶液与和mrna溶液在微混合器中充分、迅速的混合，形成粒径均一的lnp。由于脂质溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性缓冲液中，因此需要透析去除残余的乙醇并换液至pbs。
实验材料：
dlin-mc3 、dspc、dmg-peg2000、冰醋酸、三水醋酸钠
实验步骤：
1、配置脂质乙醇溶液：
a)lnp的成分与分子量见下表：
名称
摩尔比%
分子量
质量
dlin-mc3
50
642.09
130mg
dspc
10
790.2
33mg
peg-2000
1.5
2509.2
16mg
cho
38.5
386.654
62mg
无水乙醇（ar)
100ml
百分比来源于前期研究，并不一定与onpattro和mrna-1273相同。
b)每种成分别配置三个浓度：8mm（约5mg/ml）、12mm（约7.5mg/ml）和16mm（约10mg/ml）。
名称
重量或体积
冰醋酸
8ml
三水醋酸钠
3.2g
纯化水
1000ml
2、计算mrna浓度：
a)根据n/p=6，frr=3计算所需rna浓度。
b)rna的碱基的平均分子量为340，每个碱基携带1个磷酸，因此rna中的含磷量为3.1nmol/μg.
c)计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数，因此每摩尔混合脂质中含有0.5摩尔n。
脂质浓度(mm)
8
12
16
n/p
6
6
6
frr
3
3
3
rna浓度(μg/ul)
0.072
0.108
0.143
3、配置mrna-醋酸缓冲液：
称取3.2g三水醋酸钠，8ml冰醋酸，定容于1000ml。加入相应梯度的mrna
4、微流控混合：
a.将脂质-乙醇溶液过0.22μm疏水聚四氟乙烯膜，mrna-柠檬酸缓冲液过0.22μm亲水聚四氟乙烯膜，过膜后装入微量注射器中。
b.以frr=3，磷脂和缓冲液以0.2ml/min和0.6ml/min，通过nexstarnano1芯片，混合。
5、透析与储存：
a)制备后放入透析管（slide-a-lyzer™minidialysisdevice,10kmwco,0.5ml）中加入14mlpbs在摇床上透析，2小时后换液，直至18小时后透析结束。
b)保存于4℃待用。
实验名称：lnp包封率测定
实验目的：
对制备的lnp包封mrna的效果进行测定
实验原理：
quant-it™ribogreen®rna试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂，可检测溶液中1-200ng的核酸，这种核酸染料无法透过lnp，因此只有游离的未被lnp包载的核酸可以被结合。triton-100作为一种表面活性剂常被用做破乳剂，使用1%的triton-100处理获得的lnp-mrna可以使包载的核酸释放，得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量，再除以总核酸量即可得到包封率，即：
包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量
实验材料：
quant-it™ribogreen™ （sigma-aldrich，t8787-100ml）、
lnp-mrna
rna检测试剂盒（thermofisher，r11490）、triton™x-100
depc水、cellcarrier-96ultramicroplates（perkinelmer，6055308）、
实验步骤：
1.lnp制备：
见lnp制备流程。
2.试剂准备（详细参见说明书）：
将20xte用depc水稀释至1x；
用稀释好的1xte稀释试剂盒中的标准品，稀释成2μg/ml及100ng/ml两种终浓度；
用1xte稀释试剂盒中的quantit™ribogreen®reagen，稀释成200倍及2000倍两种终浓度；按照下表在cellcarrier-96ultramicroplates中加入以下试剂，做复孔：
highrange
3.lnp破乳
将triton-100用1xte稀释到2%，取100μl加入cellcarrier-96ultramicroplates，加入1μl制备好的
lnp，处理5分钟，加入100μl200-folddilutedquant-itribogreenreagent。
4.lnp游离核酸测定
在cellcarrier-96ultramicroplates中加入100ul1xte，取1μl制备好的lnp加进去，混匀，加入100μll2000-folddilutedquant-itribogreenreagent。
5.读板
使用spark读取荧光强度，激发光设置为480nm，发射光为520nm
6.数据处理
1）标曲制备
2)样品定量
载药量=破乳后读值-破乳前读值包封率（%）=载药量/破乳后读值
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实验材料：
dlin-mc3 、dspc、dmg-peg2000、冰醋酸、三水醋酸钠
实验步骤：
1、配置脂质乙醇溶液：
a)lnp的成分与分子量见下表：
名称
摩尔比%
分子量
质量
dlin-mc3
50
642.09
130mg
dspc
10
790.2
33mg
peg-2000
1.5
2509.2
16mg
cho
38.5
386.654
62mg
无水乙醇（ar)
100ml
百分比来源于前期研究，并不一定与onpattro和mrna-1273相同。
b)每种成分别配置三个浓度：8mm（约5mg/ml）、12mm（约7.5mg/ml）和16mm（约10mg/ml）。
名称
重量或体积
冰醋酸
8ml
三水醋酸钠
3.2g
纯化水
1000ml
2、计算mrna浓度：
a)根据n/p=6，frr=3计算所需rna浓度。
b)rna的碱基的平均分子量为340，每个碱基携带1个磷酸，因此rna中的含磷量为3.1nmol/μg.
c)计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数，因此每摩尔混合脂质中含有0.5摩尔n。
脂质浓度(mm)
8
12
16
n/p
6
6
6
frr
3
3
3
rna浓度(μg/ul)
0.072
0.108
0.143
3、配置mrna-醋酸缓冲液：
称取3.2g三水醋酸钠，8ml冰醋酸，定容于1000ml。加入相应梯度的mrna
4、微流控混合：
a.将脂质-乙醇溶液过0.22μm疏水聚四氟乙烯膜，mrna-柠檬酸缓冲液过0.22μm亲水聚四氟乙烯膜，过膜后装入微量注射器中。
b.以frr=3，磷脂和缓冲液以0.2ml/min和0.6ml/min，通过nexstarnano1芯片，混合。
5、透析与储存：
a)制备后放入透析管（slide-a-lyzer™minidialysisdevice,10kmwco,0.5ml）中加入14mlpbs在摇床上透析，2小时后换液，直至18小时后透析结束。
b)保存于4℃待用。
实验名称：lnp包封率测定
实验目的：
对制备的lnp包封mrna的效果进行测定
实验原理：
quant-it™ribogreen®rna试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂，可检测溶液中1-200ng的核酸，这种核酸染料无法透过lnp，因此只有游离的未被lnp包载的核酸可以被结合。triton-100作为一种表面活性剂常被用做破乳剂，使用1%的triton-100处理获得的lnp-mrna可以使包载的核酸释放，得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量，再除以总核酸量即可得到包封率，即：
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lnp，处理5分钟，加入100μl200-folddilutedquant-itribogreenreagent。
4.lnp游离核酸测定
在cellcarrier-96ultramicroplates中加入100ul1xte，取1μl制备好的lnp加进去，混匀，加入100μll2000-folddilutedquant-itribogreenreagent。
5.读板
使用spark读取荧光强度，激发光设置为480nm，发射光为520nm
6.数据处理
1）标曲制备
2)样品定量
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