基因编辑在免疫细胞治疗中的应用
基因编辑在免疫细胞治疗中的应用
1.基因编辑是什么？基因编辑是通过人工核酸酶技术将靶基因或转录产物进行敲除，插入等精确修饰的基因工程技术。目前基因编辑已经在多个领域中有着重要的应用，在肿瘤治疗中主要与免疫治疗相结合，尤其在免疫细胞治疗上有巨大的发展前景。
2.基因编辑的分类？目前的基因编辑技术有可编程的核酸酶技术和be（base editors)及pe（prime editors）技术（图1）。
图1.基因编辑技术分类[1]
可编程核酸酶主要包括锌指核酸酶(zfns)和转录激活因子样效应核酸酶(talens)以及crispr-cas核酸酶，这三种编辑方式都是将目的dna打断后产生双链断裂（dsb），后续依赖非同源末端连接或同源定向重组的方式进行修复。zfns是最早用于哺乳动物细胞基因编辑的人工核酸酶，通过锌指结构域识别dna序列并通过fok1的二聚体对dna进行定点切割。zfns作为第一代基因编辑技术其基因修复方式多样，对基因表达程度影响较小，但是其设计与筛选过程复杂，脱靶风险高并且细胞毒性大。talens作为第二代基因编辑技术，结构类似于zfns，其毒性较低且构建容易。然而，talens在尺寸上比zfns大，组装更加困难。后续出现的crispr-cas核酸酶的出现则开启了新的基因编辑时代。相较于zfns和talens，crispr/cas具有良好的柔性和高效性，可以同时敲除多个基因位点，其中以crispr-cas9应用最为广泛。crispr/cas9基因编辑系统包括cas9蛋白和单链向导 rna (sgrna)，在sgrna的向导下通过碱基互补配对原则从而识别目的基因序列，并引导cas9蛋白酶有效切割dna双链，形成双链断裂损伤后修复。
be系统主要由dcas9，sgdna和脱氨酶组成，通过对基因组 dna中的单核苷酸转换以实现精确的基因校正，无需产生dsb，从而克服了核酸酶的许多限制，主要包括胞嘧啶碱基编辑器(cbe)和腺嘌呤碱基编辑器(abe)。pe则进一步在be的系统引入逆转录酶，将切口酶与逆转录酶偶联在一起，实现单碱基的转换，敲除以及添加等操作。碱基编辑技术具有编辑效率高、编辑损伤少等特点，但是脱氨酶的使用可能会导致癌变风险的增加，而且可能出现的脱靶效应会严重影响编辑效率，其可靠性有待进一步研究。
3.基因编辑在免疫细胞治疗中的应用近年来，免疫细胞疗法在治疗癌症方面表现出优异的疗效，目前已经有多款car-t疗法在国内外获批上市，多种同种异体car-t疗法，tcr-t细胞疗法，til疗法，car-nk疗法也在临床试验中获得佳绩。第三代基因编辑技术crispr/cas发展至今，目前已衍生出不同功能工具。在免疫细胞治疗方面，crispr-cas技术已经被广泛的研究并且应用（图2）。
图2.crispr技术在t细胞治疗中的应用[2]
利用crispr/cas9系统可以敲除供体t细胞的tcr和hla，可以有效避免移植物抗宿主病（gvhd）和免疫排斥反应，该策略在开发通用型car-t细胞中已被广泛应用。除此之外，crispr-cas9技术可以通过敲除免疫检查点（如pd-1，ctla-4，tim-3等）以及一些抑制性信号通路分子（如aar2，tgfbr2，dgks等），以提高t细胞在肿瘤免疫抑制微环境中的持久性，并增强其抗癌活性[2]。在tcr-t治疗中，crispr基因编辑系统还可以用于敲除内源性的tcrα和β基因，减少内源性tcr的错配，从而改善tcr-t细胞疗法的抗癌活性，并且其安全性也在临床实验中得到验证。目前stadtmauer教授团队使用crispr技术同时敲除trac, trbc 和pdcd1三个基因，再通过慢病毒将ny-eso-1 tcr转至t细胞中，这种生成的靶向ny-eso-1抗原的tcr-t细胞疗法在３名患者中表现出良好的安全性[3]。crispr技术还可以通过同源重组的方式将带有car基因的模板dna特异性的插入至特定的基因位点，无需使用传统的逆转录或者慢病毒载体，减少基因整合的风险。justin eyquem将靶向cd19的car通过crispr/cas9定向插入t细胞的trac位点，可以有效调控car的转录表达，并减缓t细胞的分化和衰竭，增加t细胞治疗效力[4]。除了cas9外，cas12a/cpf1也是肿瘤免疫细胞疗法的有力工具。cpf1作为一种不需要tracrrna的crrna引导的核酸内切酶，可以同时对多个基因进行编辑；与cas9相比，cpf1的脱靶率低；同时切割产生的粘性末端，让dna插入更可控。陈斯迪教授课题组人员通过cpf1-aav系统，实现了hdr介导的双car敲入和免疫检查点基因敲除（图3）。相比于cas9制备的car-t细胞，aav-cpf1 kiko的car-t细胞有着更强杀伤肿瘤细胞能力，同时pd-1等耗竭型标志物的表达水平更低[5]。2023年，该团队该开发了一个基于crispr的高效、高通量基因敲入平台——clash，通过腺相关病毒（aav）文库编码大量同源重组修复模板，结合crispr-cas12a的mrna，从而实现大规模长链基因片段的精准敲入[6]。
图3.aav-cpf1介导的多重基因编辑流程[5]
近年来，除了健康供体外周血来源的pbmc外，ipsc在基因编辑技术的加持下，已逐渐发展为通用型细胞药物的细胞来源之一。fate therapeutics公司的细胞药物ft819，通过基因编辑将靶向cd19的新型car插入t细胞受体α基因座位点，进而分化产生不受患者限制的ipsc来源的通用car-t细胞（图4）。除了car-it外，fate还运用ipscs解决nk细胞来源问题，从而规避外周血nk细胞数量不足和脐带血nk细胞的伦理等风险，通过敲除内源性cd38提高nk细胞的适应性并特异性预防cd38单抗介导的自相残杀（图5）。同时有研究发现，用基因编辑敲除ipsc来源的nk细胞的cish基因，能够使nk细胞代谢重编程，并其在体内的持久性和抗肿瘤活性[7]。
图4 . ft819结构
图5.ft522结构
crispr基因编辑系统作为一种强而有力的工具，还可以通过与高通量测序技术联用，筛选能够提高免疫疗法疗效的基因靶点，目前已经有多项研究发现了新的t细胞激活调节因子，t细胞代谢调节因子，以及抗原处理/呈递通路和干扰素通路中的创新靶点[8]（图6）。西湖大学谢琦团队利用基于crispr 基因编辑系统的全基因组功能缺失性文库分别对于car-t细胞和胶质瘤干细胞（gbm中恶性程度最高的细胞群）进行高通量无偏向的筛选，发现了多个能显著提高靶向gbm的car t细胞抗肿瘤效力的新靶点[9]。除此之外，研发人员基于crispr-cas9开发出同源定向诱变（hdm）技术用于car序列的高通量的筛选[10]。
图6.slice筛选平台[8]
4.基因编辑在免疫细胞治疗中的挑战尽管基因编辑在提高免疫细胞治疗效果方面显示出巨大的潜力，但是由于其安全性和有效性等问题在一定程度上影响其向临床转化。
首先，对于基因编辑策略而言, 最大的担忧是潜在的脱靶毒性，一旦发生脱靶，将导致非靶标基因的改变或调控元件的破坏，会造成不可逆转的后果。尽管利用预测软件能够分析出潜在脱靶位点, 但是在一些非典型pam位点或者与靶点相似度较低位点仍然有可能有脱靶现象发生。同时，全基因组测序分析对于概率极低的脱靶现象也很有可能出现假阴性的结果。近年来, 许多灵敏度的体内、体外实验方法被开发出来例如guide-seq, circle-seq, change-seq等以帮助检测潜在的低频脱靶位点。新型基因编辑系统例如pe以及be编辑系统也逐渐应用于免疫细胞治疗中。这些方法在免疫细胞治疗中的合理运用将会对临床实验的安全性起到重要的作用。同时以过继性细胞治疗为基础的肿瘤免疫细胞治疗，主要包括car-t细胞、tcr-t细胞和car-nk细胞治疗等，均需要足够数量的免疫细胞保证其临床疗效。目前大多数基于crispr/cas技术编辑的t细胞都是通过电穿孔的方法进行转导，但是该方法对细胞损伤较大，致使细胞的活力下降并阻碍其体外增殖。因此，其他更安全、更高效的传递途径亟待探索。
参考文献1.raguram a.et al.therapeutic in vivo delivery of gene editing agents.cell.2022 jul 21;185(15):2806-2827.2.elmas e.et al.crispr gene editing of human primary nk and t cells for cancer immunotherapy.front oncol.2022 apr 5;12:834002.3.stadtmauer ea.et al.crispr-engineered t cells in patients with refractory cancer.science.2020 feb 28;367(6481):eaba7365.4.j.eyquem.et al.,targeting a car to the trac locus with crispr/cas9 enhances tumour rejection,nature 543(7643)(2017)113–117.5.dai x.et al.one-step generation of modular car-t cells with aav-cpf1.nat methods.2019 mar;16(3):247-254.6.dai x.et al..massively parallel knock-in engineering of human t cells.nat biotechnol.2023 jan 26.doi:10.1038/s41587-022-01639-x.7.zhu h.et al.metabolic reprograming via deletion of cish in human ipsc-derived nk cells promotes in vivo persistence and enhances anti-tumor activity.cell stem cell.2020 aug 6;27(2):224-237.8.shifrut e.et al.genome-wide crispr screens in primary human t cells reveal key regulators of immune function.cell.2018 dec 13;175(7):1958-1971.e15.9.wang d.et al.crispr screening of car t cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.cancer discov.2021 may;11(5):1192-1211.10.parola c.et al.antibody discovery and engineering by enhanced crispr-cas9 integration of variable gene cassette libraries in mammalian cells.mabs.2019 nov-dec;11(8):1367-1380.
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1.基因编辑是什么？基因编辑是通过人工核酸酶技术将靶基因或转录产物进行敲除，插入等精确修饰的基因工程技术。目前基因编辑已经在多个领域中有着重要的应用，在肿瘤治疗中主要与免疫治疗相结合，尤其在免疫细胞治疗上有巨大的发展前景。
2.基因编辑的分类？目前的基因编辑技术有可编程的核酸酶技术和be（base editors)及pe（prime editors）技术（图1）。
图1.基因编辑技术分类[1]
可编程核酸酶主要包括锌指核酸酶(zfns)和转录激活因子样效应核酸酶(talens)以及crispr-cas核酸酶，这三种编辑方式都是将目的dna打断后产生双链断裂（dsb），后续依赖非同源末端连接或同源定向重组的方式进行修复。zfns是最早用于哺乳动物细胞基因编辑的人工核酸酶，通过锌指结构域识别dna序列并通过fok1的二聚体对dna进行定点切割。zfns作为第一代基因编辑技术其基因修复方式多样，对基因表达程度影响较小，但是其设计与筛选过程复杂，脱靶风险高并且细胞毒性大。talens作为第二代基因编辑技术，结构类似于zfns，其毒性较低且构建容易。然而，talens在尺寸上比zfns大，组装更加困难。后续出现的crispr-cas核酸酶的出现则开启了新的基因编辑时代。相较于zfns和talens，crispr/cas具有良好的柔性和高效性，可以同时敲除多个基因位点，其中以crispr-cas9应用最为广泛。crispr/cas9基因编辑系统包括cas9蛋白和单链向导 rna (sgrna)，在sgrna的向导下通过碱基互补配对原则从而识别目的基因序列，并引导cas9蛋白酶有效切割dna双链，形成双链断裂损伤后修复。
be系统主要由dcas9，sgdna和脱氨酶组成，通过对基因组 dna中的单核苷酸转换以实现精确的基因校正，无需产生dsb，从而克服了核酸酶的许多限制，主要包括胞嘧啶碱基编辑器(cbe)和腺嘌呤碱基编辑器(abe)。pe则进一步在be的系统引入逆转录酶，将切口酶与逆转录酶偶联在一起，实现单碱基的转换，敲除以及添加等操作。碱基编辑技术具有编辑效率高、编辑损伤少等特点，但是脱氨酶的使用可能会导致癌变风险的增加，而且可能出现的脱靶效应会严重影响编辑效率，其可靠性有待进一步研究。
3.基因编辑在免疫细胞治疗中的应用近年来，免疫细胞疗法在治疗癌症方面表现出优异的疗效，目前已经有多款car-t疗法在国内外获批上市，多种同种异体car-t疗法，tcr-t细胞疗法，til疗法，car-nk疗法也在临床试验中获得佳绩。第三代基因编辑技术crispr/cas发展至今，目前已衍生出不同功能工具。在免疫细胞治疗方面，crispr-cas技术已经被广泛的研究并且应用（图2）。
图2.crispr技术在t细胞治疗中的应用[2]
利用crispr/cas9系统可以敲除供体t细胞的tcr和hla，可以有效避免移植物抗宿主病（gvhd）和免疫排斥反应，该策略在开发通用型car-t细胞中已被广泛应用。除此之外，crispr-cas9技术可以通过敲除免疫检查点（如pd-1，ctla-4，tim-3等）以及一些抑制性信号通路分子（如aar2，tgfbr2，dgks等），以提高t细胞在肿瘤免疫抑制微环境中的持久性，并增强其抗癌活性[2]。在tcr-t治疗中，crispr基因编辑系统还可以用于敲除内源性的tcrα和β基因，减少内源性tcr的错配，从而改善tcr-t细胞疗法的抗癌活性，并且其安全性也在临床实验中得到验证。目前stadtmauer教授团队使用crispr技术同时敲除trac, trbc 和pdcd1三个基因，再通过慢病毒将ny-eso-1 tcr转至t细胞中，这种生成的靶向ny-eso-1抗原的tcr-t细胞疗法在３名患者中表现出良好的安全性[3]。crispr技术还可以通过同源重组的方式将带有car基因的模板dna特异性的插入至特定的基因位点，无需使用传统的逆转录或者慢病毒载体，减少基因整合的风险。justin eyquem将靶向cd19的car通过crispr/cas9定向插入t细胞的trac位点，可以有效调控car的转录表达，并减缓t细胞的分化和衰竭，增加t细胞治疗效力[4]。除了cas9外，cas12a/cpf1也是肿瘤免疫细胞疗法的有力工具。cpf1作为一种不需要tracrrna的crrna引导的核酸内切酶，可以同时对多个基因进行编辑；与cas9相比，cpf1的脱靶率低；同时切割产生的粘性末端，让dna插入更可控。陈斯迪教授课题组人员通过cpf1-aav系统，实现了hdr介导的双car敲入和免疫检查点基因敲除（图3）。相比于cas9制备的car-t细胞，aav-cpf1 kiko的car-t细胞有着更强杀伤肿瘤细胞能力，同时pd-1等耗竭型标志物的表达水平更低[5]。2023年，该团队该开发了一个基于crispr的高效、高通量基因敲入平台——clash，通过腺相关病毒（aav）文库编码大量同源重组修复模板，结合crispr-cas12a的mrna，从而实现大规模长链基因片段的精准敲入[6]。
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图4 . ft819结构
图5.ft522结构
crispr基因编辑系统作为一种强而有力的工具，还可以通过与高通量测序技术联用，筛选能够提高免疫疗法疗效的基因靶点，目前已经有多项研究发现了新的t细胞激活调节因子，t细胞代谢调节因子，以及抗原处理/呈递通路和干扰素通路中的创新靶点[8]（图6）。西湖大学谢琦团队利用基于crispr 基因编辑系统的全基因组功能缺失性文库分别对于car-t细胞和胶质瘤干细胞（gbm中恶性程度最高的细胞群）进行高通量无偏向的筛选，发现了多个能显著提高靶向gbm的car t细胞抗肿瘤效力的新靶点[9]。除此之外，研发人员基于crispr-cas9开发出同源定向诱变（hdm）技术用于car序列的高通量的筛选[10]。
图6.slice筛选平台[8]
4.基因编辑在免疫细胞治疗中的挑战尽管基因编辑在提高免疫细胞治疗效果方面显示出巨大的潜力，但是由于其安全性和有效性等问题在一定程度上影响其向临床转化。
首先，对于基因编辑策略而言, 最大的担忧是潜在的脱靶毒性，一旦发生脱靶，将导致非靶标基因的改变或调控元件的破坏，会造成不可逆转的后果。尽管利用预测软件能够分析出潜在脱靶位点, 但是在一些非典型pam位点或者与靶点相似度较低位点仍然有可能有脱靶现象发生。同时，全基因组测序分析对于概率极低的脱靶现象也很有可能出现假阴性的结果。近年来, 许多灵敏度的体内、体外实验方法被开发出来例如guide-seq, circle-seq, change-seq等以帮助检测潜在的低频脱靶位点。新型基因编辑系统例如pe以及be编辑系统也逐渐应用于免疫细胞治疗中。这些方法在免疫细胞治疗中的合理运用将会对临床实验的安全性起到重要的作用。同时以过继性细胞治疗为基础的肿瘤免疫细胞治疗，主要包括car-t细胞、tcr-t细胞和car-nk细胞治疗等，均需要足够数量的免疫细胞保证其临床疗效。目前大多数基于crispr/cas技术编辑的t细胞都是通过电穿孔的方法进行转导，但是该方法对细胞损伤较大，致使细胞的活力下降并阻碍其体外增殖。因此，其他更安全、更高效的传递途径亟待探索。
参考文献1.raguram a.et al.therapeutic in vivo delivery of gene editing agents.cell.2022 jul 21;185(15):2806-2827.2.elmas e.et al.crispr gene editing of human primary nk and t cells for cancer immunotherapy.front oncol.2022 apr 5;12:834002.3.stadtmauer ea.et al.crispr-engineered t cells in patients with refractory cancer.science.2020 feb 28;367(6481):eaba7365.4.j.eyquem.et al.,targeting a car to the trac locus with crispr/cas9 enhances tumour rejection,nature 543(7643)(2017)113–117.5.dai x.et al.one-step generation of modular car-t cells with aav-cpf1.nat methods.2019 mar;16(3):247-254.6.dai x.et al..massively parallel knock-in engineering of human t cells.nat biotechnol.2023 jan 26.doi:10.1038/s41587-022-01639-x.7.zhu h.et al.metabolic reprograming via deletion of cish in human ipsc-derived nk cells promotes in vivo persistence and enhances anti-tumor activity.cell stem cell.2020 aug 6;27(2):224-237.8.shifrut e.et al.genome-wide crispr screens in primary human t cells reveal key regulators of immune function.cell.2018 dec 13;175(7):1958-1971.e15.9.wang d.et al.crispr screening of car t cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies.cancer discov.2021 may;11(5):1192-1211.10.parola c.et al.antibody discovery and engineering by enhanced crispr-cas9 integration of variable gene cassette libraries in mammalian cells.mabs.2019 nov-dec;11(8):1367-1380.
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