SDS-PAGE 胶染色介绍
一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较
二、考马斯亮蓝染色
cbb染色液
0.5%考马斯亮蓝g250 或r250
40%甲醇
10%乙酸
将cbb溶于甲醇中并不停的搅拌15min。加入乙酸与 ddh2o脱色液：30%甲醇
10%乙酸
染色方法：1.在摇床上染色30min.
2.脱色至蛋白点或条带清晰可见
3. ddh2o洗3-5次
三、胶体考马氏亮蓝染色colloidalcoomassiestaining（cambridgecentreforporteomics ）
sensitivity= ~100ng
1.固定：甲醇/醋酸/h2o(45:1:54)至少20min.
2.染色12-18hr。
染色液：17% (w/v)硫酸铵
34%甲醇
0.5%醋酸
0.1% (w/v)coomassieg250
3. 脱色：用h2o 脱色至蛋白点和背景清晰.
双向电泳蛋白点的切取和保存
1. 用pdquest软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。
2. 用milliq 水冲洗胶2次。
3. 用色谱纯甲醇和milliq 水冲洗ep 管
4. 将枪头(200µl)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和milliq水冲洗枪头。
5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入ep管，milliq水漂洗2次，如胶块太大，将其切成1 x1 mm的胶片。
6. 将切好的点做好标记和记录，置-80oc 保存或冻干后-20oc 存放。
注意事项：
1. 尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的pe 手套（不用乳胶手套）和帽子。
2. 不要将胶长期存放于乙酸溶液中。
3. ep管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行western blotting的容器分开，以避免casein 或bsa的污染。
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2. 用milliq 水冲洗胶2次。
3. 用色谱纯甲醇和milliq 水冲洗ep 管
4. 将枪头(200µl)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和milliq水冲洗枪头。
5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入ep管，milliq水漂洗2次，如胶块太大，将其切成1 x1 mm的胶片。
6. 将切好的点做好标记和记录，置-80oc 保存或冻干后-20oc 存放。
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2. 不要将胶长期存放于乙酸溶液中。
3. ep管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行western blotting的容器分开，以避免casein 或bsa的污染。
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