多重荧光免疫组化技术｜MedChemExpress (MCE)
多重荧光免疫组化技术多重荧光免疫组化技术(multiplex immunohistochemical，mihc) 也称作酪氨酸信号放大 (tyramide dignal amplification，tsa) 技术，是一类利用辣根过氧化酶(horseradish peroxidase, hrp) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。
该方法基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术，允许同时检测单个细胞或组织样本上的多个目标靶点，全面研究细胞组成、细胞功能和细胞间相互作用。
图 1. mihc 技术检测的多光谱成像[1]mihc 实验原理及流程tsa 技术采用 hrp 标记的二抗，hrp 催化加入体系的 tsa 衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。mihc 借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色[2]。图 2. mihc 实验原理和步骤tips：原理：带有染料标记的底物酪胺 (t) 分子在过氧化氢氧化环境下，被抗体或探针固定的 hrp 转化为具有短暂活性的中间状态 (t*)，然后被激活的中间态分子 (t*) 迅速与相接蛋白分子的富含电子区域 (酪氨酸残基) 进行稳定的共价结合，未被标记的酪胺分子将被洗脱，借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白 (包括 hrp，抗体，目标抗原) 都含有大量的酪氨酸结合位点，所以目标抗原处会富集大量标记分子，使信号被有效放大 (图 2)。
ihc、mihc 与if 区别？■ ihc 与 mihc
免疫组化，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性的研究。
：简单来说，mihc 属于 ihc 的升级版本！tips：相同点：能够完整显现组织原位形态信息。 不同点：1. 常规免疫组化的分析属于定性分析，其判断大多依赖于经验，其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析，其利用软件可对组织中的细胞进行精准的结果分析。2. 常规免疫组化受传统染色成像的限制，靶标少于 3 个，无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位，可以获取更多的生物信息，且样本需求量较少。
图 4. 癌组织单色 ihc（上）和多色谱 mihc（下）验证[3]
■ mihc 与 if
那么问题来了，mihc 与 if 又有什么区别呢？既然最后的成像都是荧光图像，那按照 if 实验就行哇，为什么要去做 mihc 呢？？？
：其实，mihc 作为一种新型的免疫化学技术，其价值自然会优于传统的 if 实验，并且二者在原理及操作步骤上均有差异。
小 m 已经用图形和表格为大家整理在下面啦~小白萌新可以关注收藏喔 ~
图 3. mihc（左）和常规三色荧光检测示意图（右）
表 1. mihc 与 if 的差异应用实例■ 应用一：肿瘤机制探究
gang wei 等人收集了透明细胞肾细胞癌 (ccrcc) 患者的肾周脂肪 (perinephric adipose tissue, pat) 和皮下白色脂肪 ( white adipose tissue,wat) 组织样本，发现肿瘤邻近脂肪细胞的解偶联蛋白 1 (uncoupling protein 1, ucp1) 表达高于远端脂肪细胞（wat 褐变的典型特征之一是 ucp1 的表达上调）。
此外，肿瘤细胞的 qrt-pcr、mihc 检测和免疫印迹均表明，在联合注射 bac-shpgc1a或 bac-shucp1 相关的肿瘤中，脂肪细胞促进的 ucp1 水平上调被抑制(图 4)。
进一步的研究发现，ccrcc 细胞分泌甲状旁腺激素相关蛋白 pthrp 以通过 pka 激活促进 pat 褐变，而 pat 介导的产热导致过量乳酸的释放以增强 ccrcc 的生长、侵袭和转移色[2]。
图 4. ucp1 水平变化的检测[4]
mihc (a), qrt-pcr (bg) and immunoblotting (c) 检测 ucp1 水平。空白对照组：786-o; 阴性对照组：786-o+bac-scramble；敲低 pgc1a 实验组：786-o+ bac-shpgc1a；敲低ucp1实验组：786-o+ bac-shucp1。
■ 应用二：免疫抑制性肿瘤微环境鉴定
halse, h 等人运用 mihc 对转移性黑色素瘤中的免疫亚群进行精准定位，数据量化了肿瘤内 (intra-tumor, it) 与肿瘤基质 (peri-tumoral, stroma) 的免疫亚群数量，以及免疫亚群与 (tumor margin, tm) 的距离。如图所示，使用 mihc 在特定肿瘤区域分析转移性黑色素瘤中免疫亚群的精确位置，观察不同免疫亚群在瘤内的表达情况。结果显示，对于黑色素瘤的 meltil026 (盆腔淋巴结) 切片，大多数 t 细胞为 cd4+t 细胞，且在肿瘤边缘 (tm) 和间质区域 (s) 突出，在肿瘤内 (it) 区域 cd4+和 cd8+t细胞数量较少。左右滑动图 5. mihc 分析 meltil026 切片中免疫亚群的精确位置[5]明星产品mce 提供用于 mihc 所需要的 vari fluor tsa 系列染料 ，可用于高密度原位标记检测。vari fluor tsa 系列通过辣根过氧化物酶 (hrp) 靶向抗原，基于酪胺的信号放大技术能够提供高灵敏度、检测极微量的目的抗原。荧光波长范围较窄，可以很好的避免 mihc 实验中的串色影响。货号
产品名称 ex/em (nm)
hy-d1838
vari fluor 350 tsa（200×）
347/448
hy-d1837
vari fluor 488 tsa（200×）
490/515
hy-d1832
vari fluor 532 tsa（200×）
527/558
hy-d1836
vari fluor 555 tsa（200×）
555/565
hy-d1835
vari fluor 594 tsa（200×）
590/617
hy-d1834
vari fluor 640 tsa（200×）
617/639
hy-d1831 vari fluor 620 tsa（200×） 617/639
hy-d1833 vari fluor 680 tsa（200×） 617/639
hy-d1839 biotin tsa（200×） /
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参考文献
[1] taube jm, et al. the society for immunotherapy of cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (ihc) and immunofluorescence (if) staining and validation [published correction appears in j immunother cancer. 2020 jun;8(1):]. j immunother cancer. 2020;8(1):e000155. [2] tan wcc, et al. overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. cancer commun (lond). 2020;40(4):135-153. [3] zhang w, et al. multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. neoplasma. 2021;68(6):1272-1282. [4] wei g, et al. the thermogenic activity of adjacent adipocytes fuels the progression of ccrcc and compromises anti-tumor therapeutic efficacy. cell metab. 2021;33(10):2021-2039.e8. [5] halse h, et al. multiplex immunohistochemistry accurately defines the immune context of metastatic melanoma. sci rep. 2018;8(1):11158. published 2018 jul 24.
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图 1. mihc 技术检测的多光谱成像[1]mihc 实验原理及流程tsa 技术采用 hrp 标记的二抗，hrp 催化加入体系的 tsa 衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。mihc 借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色[2]。图 2. mihc 实验原理和步骤tips：原理：带有染料标记的底物酪胺 (t) 分子在过氧化氢氧化环境下，被抗体或探针固定的 hrp 转化为具有短暂活性的中间状态 (t*)，然后被激活的中间态分子 (t*) 迅速与相接蛋白分子的富含电子区域 (酪氨酸残基) 进行稳定的共价结合，未被标记的酪胺分子将被洗脱，借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白 (包括 hrp，抗体，目标抗原) 都含有大量的酪氨酸结合位点，所以目标抗原处会富集大量标记分子，使信号被有效放大 (图 2)。
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：简单来说，mihc 属于 ihc 的升级版本！tips：相同点：能够完整显现组织原位形态信息。 不同点：1. 常规免疫组化的分析属于定性分析，其判断大多依赖于经验，其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析，其利用软件可对组织中的细胞进行精准的结果分析。2. 常规免疫组化受传统染色成像的限制，靶标少于 3 个，无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位，可以获取更多的生物信息，且样本需求量较少。
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那么问题来了，mihc 与 if 又有什么区别呢？既然最后的成像都是荧光图像，那按照 if 实验就行哇，为什么要去做 mihc 呢？？？
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