慢病毒包装常见问题汇总
q: 什么是moi？
a: 在微生物学中， moi是病原体(如噬菌体或病毒、细菌等)与感染目标(如细胞)的比率。对于病毒， moi是病毒颗粒数量与特定空间中存在的目标细胞数量的比率。通常可将某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的moi。
q：如何稀释病毒？
a：您可使用完培、pbs液等将病毒稀释到需要的滴度。如将滴度为5 x 109 tu/ml的病毒稀释到1 x109tu/ml，则需取20 µl病毒液加入到80 µl的完培中。
q：用于病毒感染的细胞接种量是多少？
a: 根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系： 传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在20-30%左右，则72h后细胞增殖后铺板密度约在90%左右；针对某些原代细胞： 由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50%～ 60%，但要确保在感染后3天时细胞汇合度达到90%～ 100%；针对非分裂细胞： 如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照80%的汇合度进行接种。
q：如何提高病毒对细胞的感染效率？
a：病毒对细胞的感染效率受细胞自身生长的状态，细胞数量，细胞被病毒感染的难易程度等多个因素影响。因此保证细胞生长状态良好，轮廓清晰，合适的细胞密度，选择较好的感染条件（如合适的moi值）可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如可以在加入病毒后将细胞培养板密封，用离心机在1000g条件下离心1h，再放回培养箱中正常培养。
q：加入病毒病毒后，细胞死亡很厉害，该如何处理？
a：病毒有一定的细胞毒性，如果培养过程中细胞出现了明显的病变或细胞状态变差，建议将转导时间缩短至5~8小时之间。或者调整并降低感染的moi值，并且在感染后4小时、 8 小时、 12小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要立刻对细胞进行换液操作，使用新鲜的完培替换病毒感染培养液
q：细胞能被病毒感染，但为何gfp荧光很弱？
a：gfp病毒感染细胞后，细胞中荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类等因素。在增殖较慢的细胞中感染病毒后， gfp蛋白表达达到峰值需要较长的时间。
q：腺病毒载体在体外实验中应注意哪些问题？
a：由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同，可以通过预实验来判断目的细胞中的腺病毒用量。病毒感染细胞的最佳时期是细胞处于对数生长期时，因此，在细胞消化后12～24小时加入病毒。病毒感染时细胞培养液的体积尽量小一些，以全覆盖细胞为准。一般感染腺病毒24 小时后就能检测到目的基因的表达，48 小时表达达到较高水平。
q：如何确定我所用的目的细胞是否可以被腺病毒感染？
a：腺病毒有广泛的宿主范围,它可以感染人类或者其他哺乳动物细胞系或原代细胞，包括可分裂的和不可分裂的细胞。只有少数细胞系不被感染，例如一些淋巴细胞系对腺病毒有更强的抵抗性。为了确认所使用的目的细胞是否能够被腺病毒感染，需要通过带有标记（如gfp）的腺病毒对目的细胞进行预实验。
苏州阿尔法生物携手海星提供的服务如下：
| 慢病毒包装服务：
我们可以提供研究所需敲除质粒载体构建和慢病毒包装服务。我们的慢病毒载体来源于hiv-1病毒，序列经过精心优化，提高了生物安全性、基因表达水平和病毒转导效率。慢病毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中，实现目的基因的持续稳定的表达目的产物，因此，目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达，干扰和基因敲除。
| 腺病毒（av）包装服务：
腺病毒载体（adenovirus）能够携带大片段外源dna、感染分裂细胞和非分裂细胞、诱导体液和细胞免疫应答（这对于疫苗开发是有益的）、表现出高效率的转导和高水平的转基因表达、不整合细胞dna（在细胞内保持dsdna游离体）。
我们提供第一代腺病毒（e1/e3-deleted ad5）和嵌合型腺病毒（chimeric adenovirus）包装服务。ad5病毒的感染是通过病毒颗粒表面的纤突（fiber）与细胞表面受体car（coxsackie virus and adenovirus receptor）特异性结合而介导的。 并不是所有细胞都高表达car，ad5病毒在某些不表达或者低表达car的细胞种类上的应用受限。我们开发了嵌合型腺病毒，它的感染是通过嵌合型纤突（chimeric fiber）与细胞表面分子cd46特异性结合而介导的。
| 腺相关病毒（aav）包装服务：
腺相关病毒(aav)是一种人细小病毒，目前因为能作为一种基因治疗载体而受到广泛关注。腺相关病毒主要以游离于染色体的附加形式存在，并可长期存在于非分裂期的细胞中。由于具有高组织特异性、低免疫原性、良好的扩散性、高安全性以及宿主范围广等特点，aav特别适用于体内的研究，且已成为基因治疗领域中具有前景的病毒载体之一。我们开发出一系列专有技术和试剂，从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了腺相关病毒包装工艺水平。
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a: 在微生物学中， moi是病原体(如噬菌体或病毒、细菌等)与感染目标(如细胞)的比率。对于病毒， moi是病毒颗粒数量与特定空间中存在的目标细胞数量的比率。通常可将某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的moi。
q：如何稀释病毒？
a：您可使用完培、pbs液等将病毒稀释到需要的滴度。如将滴度为5 x 109 tu/ml的病毒稀释到1 x109tu/ml，则需取20 µl病毒液加入到80 µl的完培中。
q：用于病毒感染的细胞接种量是多少？
a: 根据细胞增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系： 传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在20-30%左右，则72h后细胞增殖后铺板密度约在90%左右；针对某些原代细胞： 由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50%～ 60%，但要确保在感染后3天时细胞汇合度达到90%～ 100%；针对非分裂细胞： 如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照80%的汇合度进行接种。
q：如何提高病毒对细胞的感染效率？
a：病毒对细胞的感染效率受细胞自身生长的状态，细胞数量，细胞被病毒感染的难易程度等多个因素影响。因此保证细胞生长状态良好，轮廓清晰，合适的细胞密度，选择较好的感染条件（如合适的moi值）可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如可以在加入病毒后将细胞培养板密封，用离心机在1000g条件下离心1h，再放回培养箱中正常培养。
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