戴安非抑制离子色谱法测定减肥产品中的 左旋肉碱
引言：左旋肉碱（l-carnitine, β-羟基γ-*铵丁酸）又称肉毒碱或*t， 其化学式为c7h15o3n，分子量为162.2，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基 酸。l-肉碱的主要功能是参与动物体内的脂肪代谢，它作为载体将长链脂肪酸 从腺粒体膜外输送到膜内，促进脂肪酸的β-氧化，从而促进脂肪的代谢，因 此左旋肉碱具有多种重要的生理功能[i,ii]。左旋肉碱已广泛应用于医药、保健和 食品等领域，被瑞士、法国、美国和世界卫生组织规定为法定的多用途营养 剂。我国食品添加剂卫生标准gb2760-1996规定了左旋肉碱酒石酸盐为食品 营养强化剂，可应用于咀嚼片、饮液、胶囊、乳粉及乳饮料等。市场上已出现 了许多以左旋肉碱为主要功能的减肥产品。
左旋肉碱极性较强，缺少发色基团，定量分析困难。国内外对左旋肉碱的 测定主要有酶法[iii,iv]、电泳法[v]、电化学法[vi]，液相色谱法[vii~xiii]等。液相 色谱法中有的需要衍生、有的灵敏度较低。其它方法准确性较差，设备较贵等 原因较少使用。
离子色谱法可测定在水溶液中能电离的物质。在酸性溶液中，左旋肉碱表 现为阳离子特性，带正电荷，可用阳离子交换色谱柱分离。但左旋肉碱的两性 特征使其无法采用抑制型电导检测。为此，我们通过实验，摸索出左旋肉碱的 非抑制型离子色谱测定的新方法。该方法前处理简便、检测快速，用于实际样 品的检测，结果令人满意。
测试条件
仪器：赛默飞戴安ics系列离子色谱系统带柱温箱。 分析柱: ionpac cs17 + ionpac cg17，4 mm
流动相组成：
msa：0-22 min，5 mm；流速：1 ml/min 柱温：30 ℃
检测方式：抑制型电导检测
进样量：25 µl
样品前处理
胶囊：拆开胶囊外皮，称取其中的粉末样品约0.1 g 至100 ml容量瓶中，用超纯水定容到100 ml后，室温超声提取30 min，静置30 min，取上层清液，4000 r/min离 心20 min后，将溶液通过0.22µm尼龙滤膜和onguard ii rp柱，弃去6 ml初始流出液后采集2 ml样品用于离子色 谱测定。
咀嚼片：将咀嚼片粉碎，混匀，称取其中的粉末样 品约0.1 g至100ml容量瓶中，用超纯水定容到100 ml 后，室温超声提取30 min，静置30 min，取上层清液， 4000 r/min离心20 min后，将溶液通过0.22µm尼龙滤膜和 onguard ii rp柱，弃去6 ml初始流出液后采集2 ml样品 用于离子色谱测定。
onguard ii rp柱（2.5 cc），预先使用10 ml甲醇和 15 ml水活化。
结果与讨论
1. 前处理条件的选择
减肥产品中，通常加入左旋肉碱稳定形式的左旋肉 碱酒石酸盐。左旋肉碱酒石酸盐易溶于水，但不易溶于有 机溶剂。离子色谱的淋洗液是水溶液，因此选用水作提取 剂。对用水作溶剂提取极性化合物，超声提取是有效的提 取方法。我们考察了用超声提取时，提取温度与提取时间 对回收率的影响，实验结果列于表1和表2。
从表1数据可见，增加提取时间，测得结果逐渐增 大，当提取时间大于20 min后，提取效率增大不明显了。 考虑到某些基体复杂的减肥产品，可将提取时间适当延 长，因此提取时间选择为30 min。表2中，30 ℃时测得左 旋肉碱含量已经是50 ℃时的99.9%，这说明30 ℃左旋肉 碱的提取已经充分。因此选择在30 ℃、30 min下超声提取 即可。
2. 色谱柱的选择
按实验方法，我们比较了左旋肉碱在ionpac scs1、 ionpac cs12a、ionpac cs17三种不同色谱柱上的出 峰及分离情况。scs1柱为硅胶基质的色谱柱，不耐酸 碱，虽然可用低浓度（3 mm）的淋洗液等度洗脱，但l肉碱在该柱拖尾严重，对称因子为4.05，灵敏度不高。 cs12a柱的离子交换功能基团为羧基/磷酸基，柱容量 高（2800 ueq），亲水性较cs17柱弱，对一价和二价 阳离子的保留相对较强，对疏水性比较强的l-左旋肉碱 离子保留比较强，需用高浓度的淋洗液才能洗脱保留的 阳离子，这会导致高的背景电导和高的检出限。采用 15.56 mm的甲基磺酸在cs12a柱上等度淋洗左旋肉碱
背景电导5371 us，色谱峰的对称因子2.25，理论塔板数 1936，可见对称性和柱效也不好。cs17柱功能基团为 羧酸基，柱容量（1450 ueq）较cs12a柱低，可用较低 浓度的淋洗液洗脱一价和二价阳离子，因此降低背景电 导，提高检出限。l-肉碱在此色谱上对称性良好，5 mm 等度淋洗，对称因子为1.17，与可能存在的其它阳离子 易于分开。因此，选择cs17 + cg17作为分析l-左旋肉碱 的色谱柱。
3. 淋洗液浓度的确定
我们选用不同浓度的甲基磺酸，测定混合标样a中左 旋肉碱的色谱分析特征。随着淋洗液浓度降低，背景电导 降低，噪声降低，理论塔板数提高，各成分间的分离度增 大，对称因子降低，峰形改善（如表3所示）。但由于浓 度降低，酸度降低，导致峰高降低，灵敏度降低。因为l肉碱是弱碱，溶液的酸度减弱，l-肉碱的解离减弱，电导 响应也将减弱。同时，更低浓度的酸使各成分的保留时间 明显增长，特别是两价离子的保留时间增加更多，当浓度 降低到3 mmol/l时，ca2+离子的保留时间大于50 min，不 利于提高分析效率（如表4所示）。综合考虑，我们选择 5 mmol/l的甲基磺酸作为分析用淋洗液。
4. 干扰实验
由于钾、钠、钙、镁、铵为水中的常见离子，在样 品中普遍存在。而某些含左旋肉碱的保健产品也会添加胆 碱类类物质例如*及乙酰*来促进脂肪运输和神经发 育。因此我们考察了常见阳离子及*和乙酰*对左旋 肉碱出峰的影响。从图1可见，常见六种阳离子能与左旋 肉碱较好分离。50 mg/l的*和乙酰*与400 mg/l的 左旋肉碱出峰互相不干扰，分离度达到2.72．
5. 检出限与线性范围
按实验方法在选定的色谱条件下，对左旋肉碱进行 线性和检出限测定。检出限按照s/n=3进行测算，noise= 0.06 µs。数据见表5。在选定的浓度范围内，线性相关系 数r>0.999。左旋肉碱检出限1 mg/g。
6. 精密度与回收率 按实验方法，取减肥产品进行不同浓度加标试验连续进样5次，测定左旋肉碱平均回收率和精密度，结果 列于表5，该方法的回收率在87.9%~106%之间，rsd小 于6.6%。
实际样品分析
按实验方法，对市售标示含有左旋肉碱的减肥产品进 行了测试，结果见表7及图2。
结论
采用非抑制型赛默飞戴安ics系列离子色谱来测定左旋肉碱具有简 单、快速、干扰少、环保等特点。相比常见液相色谱方 法，无需衍生化，避免了繁琐的操作，节约时间，重复 性好。该方法可用于减肥产品中左旋肉碱的含量测定。
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离子色谱法可测定在水溶液中能电离的物质。在酸性溶液中，左旋肉碱表 现为阳离子特性，带正电荷，可用阳离子交换色谱柱分离。但左旋肉碱的两性 特征使其无法采用抑制型电导检测。为此，我们通过实验，摸索出左旋肉碱的 非抑制型离子色谱测定的新方法。该方法前处理简便、检测快速，用于实际样 品的检测，结果令人满意。
测试条件
仪器：赛默飞戴安ics系列离子色谱系统带柱温箱。 分析柱: ionpac cs17 + ionpac cg17，4 mm
流动相组成：
msa：0-22 min，5 mm；流速：1 ml/min 柱温：30 ℃
检测方式：抑制型电导检测
进样量：25 µl
样品前处理
胶囊：拆开胶囊外皮，称取其中的粉末样品约0.1 g 至100 ml容量瓶中，用超纯水定容到100 ml后，室温超声提取30 min，静置30 min，取上层清液，4000 r/min离 心20 min后，将溶液通过0.22µm尼龙滤膜和onguard ii rp柱，弃去6 ml初始流出液后采集2 ml样品用于离子色 谱测定。
咀嚼片：将咀嚼片粉碎，混匀，称取其中的粉末样 品约0.1 g至100ml容量瓶中，用超纯水定容到100 ml 后，室温超声提取30 min，静置30 min，取上层清液， 4000 r/min离心20 min后，将溶液通过0.22µm尼龙滤膜和 onguard ii rp柱，弃去6 ml初始流出液后采集2 ml样品 用于离子色谱测定。
onguard ii rp柱（2.5 cc），预先使用10 ml甲醇和 15 ml水活化。
结果与讨论
1. 前处理条件的选择
减肥产品中，通常加入左旋肉碱稳定形式的左旋肉 碱酒石酸盐。左旋肉碱酒石酸盐易溶于水，但不易溶于有 机溶剂。离子色谱的淋洗液是水溶液，因此选用水作提取 剂。对用水作溶剂提取极性化合物，超声提取是有效的提 取方法。我们考察了用超声提取时，提取温度与提取时间 对回收率的影响，实验结果列于表1和表2。
从表1数据可见，增加提取时间，测得结果逐渐增 大，当提取时间大于20 min后，提取效率增大不明显了。 考虑到某些基体复杂的减肥产品，可将提取时间适当延 长，因此提取时间选择为30 min。表2中，30 ℃时测得左 旋肉碱含量已经是50 ℃时的99.9%，这说明30 ℃左旋肉 碱的提取已经充分。因此选择在30 ℃、30 min下超声提取 即可。
2. 色谱柱的选择
按实验方法，我们比较了左旋肉碱在ionpac scs1、 ionpac cs12a、ionpac cs17三种不同色谱柱上的出 峰及分离情况。scs1柱为硅胶基质的色谱柱，不耐酸 碱，虽然可用低浓度（3 mm）的淋洗液等度洗脱，但l肉碱在该柱拖尾严重，对称因子为4.05，灵敏度不高。 cs12a柱的离子交换功能基团为羧基/磷酸基，柱容量 高（2800 ueq），亲水性较cs17柱弱，对一价和二价 阳离子的保留相对较强，对疏水性比较强的l-左旋肉碱 离子保留比较强，需用高浓度的淋洗液才能洗脱保留的 阳离子，这会导致高的背景电导和高的检出限。采用 15.56 mm的甲基磺酸在cs12a柱上等度淋洗左旋肉碱
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5. 检出限与线性范围
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6. 精密度与回收率 按实验方法，取减肥产品进行不同浓度加标试验连续进样5次，测定左旋肉碱平均回收率和精密度，结果 列于表5，该方法的回收率在87.9%~106%之间，rsd小 于6.6%。
实际样品分析
按实验方法，对市售标示含有左旋肉碱的减肥产品进 行了测试，结果见表7及图2。
结论
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