共聚焦显微镜的分辨率和对比度
所有光学显微镜，包括常规的宽视野，共焦和双光子仪器，在一系列基本物理因素的限制下，其分辨率均受到限制。在理想的光学系统中，分辨率受光学组件的数值孔径和入射（激发）和检测（发射）光波长的限制。分辨率的概念与对比度是分不开的，它定义为两点之间的小间隔，从而在两点之间形成一定程度的对比度。在典型的荧光显微镜中，对比度取决于从样本中收集的光子数量，信号的动态范围，成像系统的光学像差以及图像元素（像素）的数量。）在终图像中的每单位面积。
噪声对两个紧密间隔的小物体的图像的影响与上述相关因素进一步相互关联，并且很容易影响终图像的质量。尽管许多仪器和实验变量对图像对比度以及因此对分辨率的影响是*的，而且相当明显，但是由于将图像划分为有限数量的图像元素（像素）而对有效分辨率的限制可能并不为人所知。那些是数码显微镜新手。由于所有采用激光扫描仪和/或照相机系统的数字共焦图像都是根据离散像素内的测量值进行记录和处理的，因此需要对采样理论的概念进行一些讨论。
除了分辨率的简单的理论方面之外，无论分辨率如何定义，对比度和分辨率之间的相互关系都具有实际意义，因为大多数显微学家感兴趣的问题不是分辨率，而是可见性。识别两个紧密间隔的特征是分开的功能取决于人类视觉系统的高级功能来解释强度模式，并且比基于衍射理论计算分辨率值更具主观性。实验的局限性和标本本身的性质差异很大，这表明无法在显微镜的理论大分辨率下进行成像。
对比度和分辨率之间在区分两个紧密间隔的标本特征的能力之间的关系意味着不能不参考对比度就无法定义分辨率，正是这种相互依赖性导致涉及分辨率和影响其的因素产生了很大的歧义。在显微镜下。荧光蛋白技术的进展已导致活细胞和组织中动态过程研究的巨大增加。这样的标本在光学上很厚且不均匀，导致显微镜中的成像情况远非理想。其他因素，例如细胞活力以及对热损伤和光漂白的敏感性，对光强度和曝光时间设置了限制，因此限制了可获得的分辨率。鉴于可用的时间尺度可能受这些因素以及记录活细胞中快速动态事件的必要性的限制，因此必须接受的是，图像质量不会像从固定和染色的标本中获得的那样高。在给定的实验情况下成像的的分辨率目标是，显微镜应在实验施加的限制范围内提供分辨率。
通风盘和横向分辨率
在显微镜中对点状光源进行成像会在图像平面中产生电磁场，其振幅波动可被视为光学系统对样本响应的体现。该场通常通过幅度点扩展函数表示，并允许评估组合系统组件的光学传递特性。尽管不能直接观察到场振幅的变化，但是在显微镜中形成并由其成像系统记录的点源的可见图像是强度点扩散函数，它描述了实际空间中的系统响应。实际样本不是点源，但可以视为尺寸小于系统分辨率的无数对象的叠加。像平面以及轴向（图3）的强度点扩散函数（psf；见图1）的属性是确定显微镜分辨率的主要因素。
通过记录通过分辨率扫描的亚分辨率球形珠的图像，可以在显微镜下实验性地测量强度点扩散函数（在文献中可以找到许多示例）。由于直接测量强度点扩散函数存在技术难度，因此通常使用计算所得的点扩散函数来评估不同光学系统的分辨率性能，以及共焦，两光子和常规光学的光学切片能力广角显微镜。尽管强度点扩展函数在所有三个维度上均得到扩展，但就分辨率和对比度之间的关系而言，参考熟悉的方法，仅考虑强度分布的横向分量是有用的通风盘。
点扩散函数在焦平面上的强度分布由旋转对称的艾里图案来描述。由于显微镜透镜的圆柱对称性，两个侧面分量（x和yairy模式的）等效），该模式表示横向强度分布与距光轴距离的关系。横向距离由系统的数值孔径和光的波长归一化，因此是无量纲的。图1（艾里斑和强度函数）以图解方式说明了艾里斑的形成和特性，相关的三维点扩散函数以及荧光显微镜中的艾里图案。在点状标本区域中激发荧光团之后，荧光发射在所有方向上发生，
艾里图案强度分布是通过圆孔的弗劳恩霍夫衍射的结果，并且在理想的光学系统中显示出中心强度大值和被零强度区域分开的更高阶大值。当通过数值孔径和波长将距离归零时，光轴的零交叉距离（在图1中由变量ν表示）出现在ν值为3.8、7.0、10.2、13.3 ...等等 当将光轴上的强度标准化为一个（100％）时，前四个较高阶大值的比例高度分别为1.7％，0.4％，0.2％和0.08％。
分辨率和对比度
分辨率概念的一种有用方法是，在图像形成过程不连贯且可以分离的对象图像相互影响的前提下，考虑由两个点状对象（标本特征）形成的图像。用强度点扩散函数描述。然后，生成的图像由两个艾里斑的总和组成，其特征取决于两点之间的距离。图2表示了两个点对象在不同间距下的强度点扩展函数（即airy函数）之间的横向交互关系。当两个物体广泛分开时，根据图像强度的变化可以轻松地区分它们的图像。
如图2所示，当充分分开时，对象之间区域的强度变化是大可能的，从峰值强度（在个点）循环到零，然后在第二个中心返回到大值。点。在物体空间中的距离减小时，图像平面中两点的强度分布函数开始重叠，并且所得图像可能看起来像是单个更大或更亮的物体或特征的图像，而不是被识别为两个物体。通常，如果将分辨率定义为可以充分区分两个物体的小间隔距离，则很明显，此属性与强度峰的宽度（点扩展函数）有关。显微镜分辨率直接相关，因此，fwhm）的分量方向的仪器的强度点扩散函数的。
术语分辨率的使用有些歧义是由于定义要素及其点扩散函数之间的分隔程度的可变性“足够”以允许将它们区分为两个对象而不是一个对象。通常，显微镜标本中所关注的微小特征产生的点图像在一定程度上重叠，显示出两个由间隙隔开的峰。峰之间的间隙深度越大，区分或分辨这两个对象就越容易。通过两个重叠点扩展函数之间强度下降的深度，可以消除评估分辨率时的歧义，并引入定量方面。
为了量化分辨率，对比度的概念术语“强度”被定义为强度相等的两个对象，即它们之间的空间中出现的大强度和小强度之差。因为艾里斑的大强度归一化，所以可获得的对比度也为1，并且仅当两个对象之间的间距较大时才出现，并且具有足够的间隔以允许其组合强度中出现个零交叉分配。在减小的距离处，随着两点扩展函数开始重叠，两个大值（和对比度）之间的强度下降逐渐减小。不再可分辨两个峰值大值并且对比度变为零的距离称为对比度截止距离。对比度随距离的变化允许根据两个点的分离将分辨率定义为对比度的函数。
两个点状对象的对比度和分离距离之间的关系称为对比度/距离函数或对比度传递函数。分辨率可以定义为两个物体以一定的对比度值成像的间隔距离。显而易见的是，当存在零对比度时（图2（b）），这些点将不被解析；所谓的sparrow准则将光学系统的分辨率定义为等于对比度截止距离。但是，通常需要更大的对比度，以便在视觉上充分区分两个紧密间隔的点，而*的瑞利分辨率标准指出，当一个airy圆盘的个小值（零交叉点）与第二个airy圆盘的中心大值对齐时，会解析出两个点。在成像条件下，瑞利标准分离距离对应于26.4％的对比度值。尽管可以在定义分辨率时任何大于零的对比度值，但在典型的荧光显微镜应用中，rayleigh标准的26％对比度被认为是合理的，并且是根据以下公式定义横向分辨率的通用表达式的基础，其中图像平面中的点间距（r）是airy圆盘的中心大值与个小值之间的距离：
r 横向 = 1.22λ/（2•na）= 0.6λ/ na
其中λ是发射光的波长，na是物镜的数值孔径。
显微镜中的分辨率与显微镜的点扩散函数的fwhm尺寸直接相关，为了避免在艾里斑中鉴定大强度的困难，通常通过实验测量该值。利用点扩展函数的fwhm值进行的分辨率测量要比采用瑞利准则计算的分辨率稍小。此外，在共聚焦荧光构造中，采用逐点照明扫描和逐点检测，使得仅能够检测在照明和检测点扩散函数的共享体积中的荧光团。因此，在共焦情况下，强度点扩展函数是独立照明强度和检测强度点扩展函数的乘积。对于共聚焦荧光，与宽视野显微镜相比，点扩散函数的横向（和轴向）范围减小了约30％。由于强度点扩散函数较窄，因此在共聚焦显微镜中产生可接受的对比度所需的点分离减少到以下距离：
r 横向 = 0.4λ/ na
如果照明和荧光发射波长大致相同，则共聚焦荧光显微镜艾里斑的大小就是宽视野显微镜艾里斑的平方。因此，在共焦布置中，对比度截止距离减小了，并且与宽场照明配置相比，可以在更短的距离上实现等效对比度。无论仪器配置如何，横向分辨率都与波长成比例关系，并且与物镜数值孔径成反比。
如前所述，横向分辨率是讨论分辨率和对比度的主要关注点，尽管与宽场荧光配置相比，共焦配置中显微镜强度点扩展函数的轴向范围也有所减少。当点状物体被轴向点扩展函数分量的中心大值和小值之间的距离分开时，会在位于光轴上的点状对象之间产生合理的对比度。图3所示为典型的宽视野（图3（a））和共焦（图3（b））荧光显微镜的轴向强度分布。请注意，共焦分布中“翼”的强度显着降低，这是距中心大值的距离的函数。
文献中提出了各种方程式，这些方程式与用于计算各种显微镜配置的轴向分辨率的不同模型有关。于荧光发射的方法在形式上类似于评估景深的表达式，并证明轴向分辨率与样本介质的波长和折射率成正比，与数值孔径的平方成反比。因此，与发射波长相比，显微镜物镜的数值孔径对轴向分辨率的影响要大得多。下面给出了一个通常用于描述共焦结构的轴向分辨率的方程，其中η代表折射率，其他变量如前所述：
r 轴向 = 1.4λ• η / na2
尽管共聚焦显微镜的配置仅比宽视场显微镜在轴向分辨率上有适度的提高，但是共聚焦方法的真正优势在于厚样品的光学切片能力，与常规方法相比，有效的轴向分辨率有了显着提高技术。共聚焦显微镜的光学切片特性是由积分强度点扩展函数的特性决定的，当根据深度进行评估时，该函数在焦平面中具有大值。传统广角显微镜的强度点扩展函数的等效积分是深度的常数，因此没有光学切片功能。
影响对比度的实际因素
共聚焦显微镜在当前生物学和生物医学研究中的重要性主要来自光学切片功能，该功能可对厚样本进行三维分析，例如在涉及活细胞和组织的研究中遇到的样本。光学切片特性是通过使用点状照明和检测配置而产生的，该点状照明和检测配置将相关的共焦观察体积限制在照明和检测体积的重叠区域。为了增加感兴趣的特征的分辨率，采用了各种策略来减小该体积。常规阿贝理论描述了可以修改以提高横向分辨率的参数之间的相互作用，包括减小入射光的波长，增加标本介质的折射率，并增加光学系统的接收角（数值孔径）。其中的前两个经常受到给定实验对可使用的荧光团的要求以及保持标本生存能力的限制。
即使具有更高的数值孔径物镜，共焦针孔的使用也会将照明和检测光路限制在光学系统大立体角的很小一部分，从而导致沿光轴的点扩散函数延长。额外的研究工作已经导致了许多实验技术，以减少这种对轴向分辨率的限制，以及各种其他因素的影响，例如引入光学像差的折射率失配。在用于小化该问题的方法中，使用了高数值孔径的水浸物镜。
实现理想光学性能的许多实际限制的意义在于，不应误解传统的阿贝分辨率计算来描述显微镜的分辨率。衍射极限预测的分辨率与条件有关，包括无限的信噪比。荧光显微镜实际上受光子产量低的限制，并且要求激发与发射光子的比率通常在数百万之内。因为即使在高照明水平下，分辨率也需要一定的对比度，并且对比度受信噪比的影响，所以实际上达到的对比度水平终取决于检测到的光子数量。
除了收集的光子数量和各种光学像差外，采样过程本身是数字显微镜的基本特征，它在荧光共聚焦显微镜中起着决定对比度和分辨率的作用。如前所述，数字共焦图像不仅必须记录，而且必须在离散的像素内处理和显示，这一事实引入了成像变量，而对于数字成像新手来说，显微学家可能不熟悉这些成像变量。此外，像素化，或将图像划分为有限的图片元素，是在成像过程的几个阶段进行的，并且这些步骤必须彼此交互才能将图像信息从样本转移到终的可视图像显示。这些离散元件在各个阶段之间不匹配的可能性是另一个可能限制图像对比度和分辨率的因素。
有时会根据转盘来描述显微镜光学系统在标本级别施加的分辨率，这是小的光学可分辨元素。取决于用来定义两个元素之间的可检测强度差的标准，卷轴的大小可以对应于瑞利极限，麻雀极限或其他任意定义。通过采样对应于样本中点状特征的艾里图案，像素化或数字化的效果初会以光学分辨率级别显示在成像序列中。分区或像素化也发生在成像过程的显示阶段，并且已发表文献中术语使用的差异会导致在讨论整个成像序列各个阶段发生的数字化过程时产生混乱。术语resel术语“样品”是指标本（物体）的小区域，该区域可以与相邻区域区分开，而无需考虑随后的检测，处理或显示。在三维共聚焦成像中，尽管没有理由将转轴的概念限制为二维，但有时将体积分辨率元素称为体素，并且该术语可用于描述小空间分辨元素（在二维或三维上），由显微镜系统的光学元件确定。
图4说明了一种机制，通过该机制对紧密排列的艾里图案的强度进行采样的过程会降低图像对比度。通常假定艾里图案是由无数个样本（或数据点）描述的平滑连续函数，如整个图案上强度变化的典型模拟表示所示。当视为连续函数时，艾里图案会显示出它们的全部强度变化，并在给定的分隔距离下产生大的理论对比度。例如，如果通过扫描仪或数字成像设备将其划分为有限数量的测量点或区域，则平滑曲线将转换为一系列强度值，每个强度值都可以存储在计算机存储位置中。通过离散采样
每个像素平均或汇总区域内光学系统的强度响应。由于艾里函数过零发生在点而不是区域上，因此对于任何有限的像素大小，像素值都不能为零。类似地，通过面积平均来减小测得的强度峰值的大值，并且增大小值和减小大值的组合效果是减小对比度。因此，像素化过程会增加截止距离，降低分辨率（对于任何对比度标准）。此外，如果相对于转盘尺寸的像素尺寸太大，则在图像平面中的强度响应的小值和大值的位置引入模糊性。
不可避免的是，光学系统中固有的分辨率没有被检测器充分采样，这会丢失。随着更多像素用于描述强度变化，像素化的影响已降至低。几种检测器设计获取像素化数据作为检测器的固有属性（例如ccd摄像机），而其他检测器设计则需要在检测之后通过模数转换器或类似数字转换器将连续的模拟信号数字化。利用单个检测通道的共聚焦激光扫描系统的线扫描以这种方式操作。像素大小与airy圆盘直径的关系决定了对两个相邻的airy圆盘进行采样以达到一定对比度所需的像素数。
确定拍摄图像的对比度和分辨率时，实际需要考虑的另一个因素是强度分辨率，它决定了分配给每个图像像素的亮度值。类似于转盘，转盘的大小由系统的光学特性决定，可以分辨的小可检测强度差取决于检测器的电子特性，尤其是其信噪比。当转移到图像输出级时，每个像素的亮度由灰度表示以及表示亮度的精度取决于所用灰度级的数量与检测器测得的小可检测强度差之间的关系。当由计算机存储时，与图像中空间位置相对应的每个像素都有一个相关的强度值，用于8位存储（256个灰度级），范围从0到255。在共聚焦显微镜中，检测分辨率很少证明使用超过256个灰度级是合理的，尽管对于某些数据处理算法来说，在区分更多强度级时可能会有一些价值。
重要的是要认识到图像显示阶段的像素化并非数字成像所*。某种形式的“颗粒度”是每种类型的图像表示中固有的，并且对颗粒的大小和组织的操纵被用来表示所需的灰度级范围。摄影胶片具有各种尺寸的银粒，电视显示器是离散的水平线的阵列，每条水平线均显示基于电子带宽的强度变化，并且半色调打印技术将黑白点分成各种尺寸的像素以模拟连续的色调变化。即使在每个像素使用一个点的情况下，视频监视器也能够改变每个显示点的强度并实现一些色调变化。然而，为了表示足够数量的灰度以产生连续色调图像的视觉效果或显示颜色变化，必须分配多个点来表示每个像素。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。为了显示颜色变化，必须分配多个点来表示每个像素。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。为了显示颜色变化，必须分配多个点来表示每个像素。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。降低视在分辨率的效果。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。降低视在分辨率的效果。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。
所有数字共聚焦显微图像都是在离散分区或像素的领域中获取，处理和显示的，而不是被视为标本数据的连续表示，这一事实不是具有根本意义的问题，而是一个成像技术的实际问题。只要显微镜根据适用的采样理论进行操作，该显微镜决定了以足够的对比度复制感兴趣的特征所需的空间或时间的采样间隔，就没有明显的限制。通常依赖的采样标准基于*的奈奎斯特定理，它了忠实地重构纯正弦波所需的采样间隔，该间隔是其频率的函数。实践中的问题是，在典型的共聚焦显微镜上使用变焦放大倍率控件很容易以违反奈奎斯特标准的方式被滥用。
奈奎斯特采样理论的应用通常是通过考虑空间频率而不是物体大小域中的样本特征来解释的。实际上，每个空间单位的对象数量（频率）与对象大小成反比，并强调了样本特征之间的间距在图像形成中的重要性。空间频域的使用与基于光学系统在传输不同频率的图像信息时保持对比度（和可见性）的能力来评估性能的实践相一致。所有光学系统都会降低成像过程中的对比度，并且对于较高的空间频率（较小的间距），此效果在较低的频率（较大的间距）下更为严重。对比度传递函数（ctf的光学系统的）是通过绘制的由具有交替的黑暗和光棒在一个频率范围内，或配置间隔周期排列的测试图案的图像中的测量对比度构成。图5展示了一个光学系统的假设ctf，其中包括系统对具有黑条和白条（对比度为100％）的测试目标以及由灰条和白条组成的目标仅产生30％对比度的系统响应的曲线。
检查图5的对比度传输曲线可以清楚地说明分辨率和对比度之间的相互依赖关系，以及一些常见假设的问题，这些假设将分辨率视为仪器性能的常数。分辨率是一个有点随意的变量，仅在其他相关因素的框架内考虑时才有意义。当定义为产生一定对比度的空间频率时，很容易假定具有分辨率范围内的频率的任何特征都是同等可见的，而实际上原本具有高对比度的标本特征要比那些具有高对比度的标本特征更清晰可见。在每个频率下降低对比度，直至对比度截止频率。曲线（图5）说明，由于染色特性或其他因素，初具有30％对比度的标本特征在空间频率接近理论极限的任何地方都不会保持瑞利的26％对比度，假设对比度相等在所有频率上达到分辨率极限。在稍稍处于分辨率极限之内的小特征的对比度产生的对比度比大特征的对比度要低得多，因为每个大特征均已被成像系统的传递函数降低。
样本特征在显微镜图像中的可见性取决于特征相对于其周围环境的对比度，在对比度传递函数中反映的光学系统的性能，信噪比统计以及信号的方式被采样以进行数字化。奈奎斯特（nyquist）发现，为了忠实地重建纯正弦波，必须在该波的每个周期内至少采样两次，或者以两倍于时间频率的频率对其采样。成像中感兴趣的频率具有空间性质，但是奈奎斯特定理同样适用于此类数据。显微成像应用中采用的小采样频率通常是要重建的大频率的2.3倍。使用值2.3（而不是2）
在图像重建之前应用于采样数据的低通滤波类似于眼睛和大脑进行的“滤波”，以平滑像素化的数据（例如半色调图像）或远离显示器（例如，大屏幕电视，以消除可见的扫描线。低通滤波可消除与数据无关的采样伪像，并有助于使图像显得连续。理想的滤波器将允许以频率2倍的频率进行采样，但是由于不存在此类设备，因此经验得出的普遍性是，以频率2.3倍的采样率足以满足实际滤波器的性能（通常是积分器数模转换器）。
在显微镜的实际操作中，估计样本中应关注的频率时通常会存在一些不确定性。许多标本具有清晰的边缘，并且具有许多微小的特征，这些特征为信号提供了*的频率成分。由光学元件施加的艾里强度分布函数或高斯分布会使这些成分模糊到一定程度，以致细节仅出现在光学分辨率极限之内。尽管没有必要在较高的频率下采样，但未能对所有低于该极限的频率分量进行采样会产生图像误差，这将不再带来样本信息（在光学传输后，见图6）。在某些情况下，应从2以上取样。信息频率的3倍，以允许错误估计频率。在共聚焦激光扫描显微镜中，要采样的频率（f）由光学系统施加，并且对于特定的分辨率规格：
f = 1 / r（分辨率）
为了保留由光学系统传输到显微镜的采样（数字化）台的所有信息，并具有对比度传输功能（如图5所示），像素大小必须小于2.3倍的倒数。截止频率（f 截止）：
像素尺寸截止
在实验所施加的限制范围内，要准确地表示样本特征，需要使用空间采样频率和电子属性（例如带通），这些属性必须与系统的光学分辨率相匹配。在共聚焦显微镜中，光学分辨率（转盘大小）主要取决于光的波长和物镜的数值孔径。显微镜上的缩放控件提供了将像素大小与光学特性进行匹配的能力，并满足了以至少两倍于标本信号空间频率的两倍来获取样品的奈奎斯特准则。通常，缩放控件会更改样本上扫描区域的大小，但不会更改采样像素的数量。因此，像素大小与缩放系数成反比。对于波长，数值孔径和物镜放大倍率的特定组合，只有一个的缩放设置：当参考标本空间时，该设置可提供与奈奎斯特标准匹配的像素大小。在除变焦设置以外的其他条件下，根据像素大小是否会导致两个不同的成像问题，数据的过采样或欠采样（图6）。
当在高于对应于奈奎斯特条件的显微镜的变焦设置下操作时，在标本上会生成较小的像素，从而在缩小的扫描区域内对数据进行过采样。以比光学分辨率所需的像素尺寸小的像素尺寸进行采样不仅会使标本遭受比所需的更严重的光致漂白，而且还会减少在给定时间内可以扫描的区域。有时认为以比对应于奈奎斯特极限的频率高得多的频率对标本特征进行采样很有用，以便获得有关特征位置的信息。以这种方式进行操作会产生称为超采样的情况，其中未解析物体的位置可能比显微镜光学分辨率所能提供的精度更高。尽管没有提供有关样本特征的详细信息，超出了转盘尺寸所允许的范围，但可以从模糊图像的强度分布中确定其位置。如果特征是由大量像素采样的，并且对于这种过采样所暗示的高光子通量是稳定的，则光斑的质心就可以在信号噪声所施加的限制范围内确定其位置。
样本数据欠采样会导致另一种类型的问题。与过采样的情况一样，这种情况是由成像序列的分配机制中的不匹配引起的。这种不匹配发生在采样频率和转盘大小（分辨率）之间，并且涉及数据中的空间频率，该空间频率高于可以由采样率准确表示的空间频率。欠采样通常发生在较低的显微镜变焦设置下，其像素大小大于奈奎斯特标准的像素大小。除了采样*遗漏了较小的特征外，其他特征可能会出现在图像中，而样本中没有这些特征。这种现象可能是由于称为混叠的过程引起的，其中标本特征在图像中所呈现的特征与标本中所呈现的特征*不同。实际上，它们以“别名”或错误身份出现，并且经常被伪装成样本中不存在的空间频率。
该过程在图7中进行了说明，其中以每微米2个频率对3微米频率的样本特征进行采样。样本分割会丢失样本数据的整个周期，并输出样本中不存在的每微米1的信号。混叠图像是由解析数据和检测器特性之间的欠采样不匹配导致的。当像素过大而产生的所谓“盲点”错过了实际特征时，混叠可能会导致出现比标本更大，更小或位置不同的特征。一旦发生采样，就无法确定哪些图像特征是真实的，哪些图像是伪像。
在如图7所示的情况下，由于无法在选定的采样率下准确呈现此尺寸的样本特征，因此必须提高采样率，或者应采用某种形式的过滤以消除超出系统可以处理的那些（超出奈奎斯特限制的那些）。每微米大于6个循环的采样将满足nyquist标准，并准确地重现样本特征，但是，如果不可能，则在大多数情况下，实际的解决方案是调整显微镜的缩放设置，以使采样与解决机制。如果无法获得足够数量的像素以正确表示样品特征，则分辨率应受到限制或降低，
限制光学分辨率的一种常用方法是采用较小的数值孔径光学组件，或者对物镜的后焦平面进行底部填充以减小其有效数值孔径。这种方法的主要缺点是，它降低了光收集效率，并且因此增加了样品曝光时间（用于图像采集），因此有可能对敏感样品造成更大的损害。降低分辨率以匹配采样属性的另一种机制是利用较大的针孔直径（或其他光学方法）来将源盘的有效大小增加到超出衍射限制的光斑大小。该技术的优点是线性地降低了横向分辨率和轴向分辨率，而数值孔径的变化会二次影响轴向分辨率。在任一情况下，共聚焦显微镜保留了其光学切片功能和*的采样灵活性。此外，通常建议在使用检测系统（例如单通道光电倍增管）时（其中信号的像素化不是检测器固有的），采样分辨率也应通过电子方式降低。对于给定的采样率，可以在模数转换器之前采用积分器，以将信号电压的采样限制为奈奎斯特的速率。采样分辨率也应通过电子方式降低。对于给定的采样率，可以在模数转换器之前采用积分器，以将信号电压的采样限制为奈奎斯特的速率。采样分辨率也应通过电子方式降低。对于给定的采样率，可以在模数转换器之前采用积分器，以将信号电压的采样限制为奈奎斯特的速率。
能够以与样本和荧光团特性一致的光斑尺寸，并适合实验要求的显微镜操作显微镜，这一点很重要。理想情况下，该仪器应能够在衍射极限配置和较大光斑尺寸下运行。在许多实验情况下，都希望通过打破与焦斑大小，针孔直径和采样频率有关的规则，以低于其衍射极限的分辨率有意操作显微镜，但操作员应始终注意证明这些偏差的情况。
SOR液位开关的接线方法，怎样接正确
喷淋塔废气处理设备解决方案
闭孔B1级橡塑保温板生产厂家
U44SM弹性密封圈不锈钢角式柱塞阀
煤电厂为什么要检测氯乙烯气体？
共聚焦显微镜的分辨率和对比度
COD检测仪如何准确检测水样呢?
数控立式车床加工工艺的注意事项
揉面机应该如何进行选择呢？
keysight 86038B 光色散和损耗分析仪 深圳市美佳特
用适当的方法予以修复PH电极
ZG系列振动给料机 ZG-40-130F振动给料机 GZG电机振动给料机
旋转流变仪的使用及原理
山东角度带锯床锯条断裂问题解析
电缆现场修补应注意哪些问题
蒸汽流量计的故障排除方法
ANDA 在萨尔瓦多安装LG Sonic MPC-Buoy(超声波除藻仪) 系统以保障供水
德国moenninghoff电磁齿轮联轴器性能要求
SDF-2型（隧道法）防火涂料测试仪四个功能有
冷水机设备的应用领域
噪声对两个紧密间隔的小物体的图像的影响与上述相关因素进一步相互关联，并且很容易影响终图像的质量。尽管许多仪器和实验变量对图像对比度以及因此对分辨率的影响是*的，而且相当明显，但是由于将图像划分为有限数量的图像元素（像素）而对有效分辨率的限制可能并不为人所知。那些是数码显微镜新手。由于所有采用激光扫描仪和/或照相机系统的数字共焦图像都是根据离散像素内的测量值进行记录和处理的，因此需要对采样理论的概念进行一些讨论。
除了分辨率的简单的理论方面之外，无论分辨率如何定义，对比度和分辨率之间的相互关系都具有实际意义，因为大多数显微学家感兴趣的问题不是分辨率，而是可见性。识别两个紧密间隔的特征是分开的功能取决于人类视觉系统的高级功能来解释强度模式，并且比基于衍射理论计算分辨率值更具主观性。实验的局限性和标本本身的性质差异很大，这表明无法在显微镜的理论大分辨率下进行成像。
对比度和分辨率之间在区分两个紧密间隔的标本特征的能力之间的关系意味着不能不参考对比度就无法定义分辨率，正是这种相互依赖性导致涉及分辨率和影响其的因素产生了很大的歧义。在显微镜下。荧光蛋白技术的进展已导致活细胞和组织中动态过程研究的巨大增加。这样的标本在光学上很厚且不均匀，导致显微镜中的成像情况远非理想。其他因素，例如细胞活力以及对热损伤和光漂白的敏感性，对光强度和曝光时间设置了限制，因此限制了可获得的分辨率。鉴于可用的时间尺度可能受这些因素以及记录活细胞中快速动态事件的必要性的限制，因此必须接受的是，图像质量不会像从固定和染色的标本中获得的那样高。在给定的实验情况下成像的的分辨率目标是，显微镜应在实验施加的限制范围内提供分辨率。
通风盘和横向分辨率
在显微镜中对点状光源进行成像会在图像平面中产生电磁场，其振幅波动可被视为光学系统对样本响应的体现。该场通常通过幅度点扩展函数表示，并允许评估组合系统组件的光学传递特性。尽管不能直接观察到场振幅的变化，但是在显微镜中形成并由其成像系统记录的点源的可见图像是强度点扩散函数，它描述了实际空间中的系统响应。实际样本不是点源，但可以视为尺寸小于系统分辨率的无数对象的叠加。像平面以及轴向（图3）的强度点扩散函数（psf；见图1）的属性是确定显微镜分辨率的主要因素。
通过记录通过分辨率扫描的亚分辨率球形珠的图像，可以在显微镜下实验性地测量强度点扩散函数（在文献中可以找到许多示例）。由于直接测量强度点扩散函数存在技术难度，因此通常使用计算所得的点扩散函数来评估不同光学系统的分辨率性能，以及共焦，两光子和常规光学的光学切片能力广角显微镜。尽管强度点扩展函数在所有三个维度上均得到扩展，但就分辨率和对比度之间的关系而言，参考熟悉的方法，仅考虑强度分布的横向分量是有用的通风盘。
点扩散函数在焦平面上的强度分布由旋转对称的艾里图案来描述。由于显微镜透镜的圆柱对称性，两个侧面分量（x和yairy模式的）等效），该模式表示横向强度分布与距光轴距离的关系。横向距离由系统的数值孔径和光的波长归一化，因此是无量纲的。图1（艾里斑和强度函数）以图解方式说明了艾里斑的形成和特性，相关的三维点扩散函数以及荧光显微镜中的艾里图案。在点状标本区域中激发荧光团之后，荧光发射在所有方向上发生，
艾里图案强度分布是通过圆孔的弗劳恩霍夫衍射的结果，并且在理想的光学系统中显示出中心强度大值和被零强度区域分开的更高阶大值。当通过数值孔径和波长将距离归零时，光轴的零交叉距离（在图1中由变量ν表示）出现在ν值为3.8、7.0、10.2、13.3 ...等等 当将光轴上的强度标准化为一个（100％）时，前四个较高阶大值的比例高度分别为1.7％，0.4％，0.2％和0.08％。
分辨率和对比度
分辨率概念的一种有用方法是，在图像形成过程不连贯且可以分离的对象图像相互影响的前提下，考虑由两个点状对象（标本特征）形成的图像。用强度点扩散函数描述。然后，生成的图像由两个艾里斑的总和组成，其特征取决于两点之间的距离。图2表示了两个点对象在不同间距下的强度点扩展函数（即airy函数）之间的横向交互关系。当两个物体广泛分开时，根据图像强度的变化可以轻松地区分它们的图像。
如图2所示，当充分分开时，对象之间区域的强度变化是大可能的，从峰值强度（在个点）循环到零，然后在第二个中心返回到大值。点。在物体空间中的距离减小时，图像平面中两点的强度分布函数开始重叠，并且所得图像可能看起来像是单个更大或更亮的物体或特征的图像，而不是被识别为两个物体。通常，如果将分辨率定义为可以充分区分两个物体的小间隔距离，则很明显，此属性与强度峰的宽度（点扩展函数）有关。显微镜分辨率直接相关，因此，fwhm）的分量方向的仪器的强度点扩散函数的。
术语分辨率的使用有些歧义是由于定义要素及其点扩散函数之间的分隔程度的可变性“足够”以允许将它们区分为两个对象而不是一个对象。通常，显微镜标本中所关注的微小特征产生的点图像在一定程度上重叠，显示出两个由间隙隔开的峰。峰之间的间隙深度越大，区分或分辨这两个对象就越容易。通过两个重叠点扩展函数之间强度下降的深度，可以消除评估分辨率时的歧义，并引入定量方面。
为了量化分辨率，对比度的概念术语“强度”被定义为强度相等的两个对象，即它们之间的空间中出现的大强度和小强度之差。因为艾里斑的大强度归一化，所以可获得的对比度也为1，并且仅当两个对象之间的间距较大时才出现，并且具有足够的间隔以允许其组合强度中出现个零交叉分配。在减小的距离处，随着两点扩展函数开始重叠，两个大值（和对比度）之间的强度下降逐渐减小。不再可分辨两个峰值大值并且对比度变为零的距离称为对比度截止距离。对比度随距离的变化允许根据两个点的分离将分辨率定义为对比度的函数。
两个点状对象的对比度和分离距离之间的关系称为对比度/距离函数或对比度传递函数。分辨率可以定义为两个物体以一定的对比度值成像的间隔距离。显而易见的是，当存在零对比度时（图2（b）），这些点将不被解析；所谓的sparrow准则将光学系统的分辨率定义为等于对比度截止距离。但是，通常需要更大的对比度，以便在视觉上充分区分两个紧密间隔的点，而*的瑞利分辨率标准指出，当一个airy圆盘的个小值（零交叉点）与第二个airy圆盘的中心大值对齐时，会解析出两个点。在成像条件下，瑞利标准分离距离对应于26.4％的对比度值。尽管可以在定义分辨率时任何大于零的对比度值，但在典型的荧光显微镜应用中，rayleigh标准的26％对比度被认为是合理的，并且是根据以下公式定义横向分辨率的通用表达式的基础，其中图像平面中的点间距（r）是airy圆盘的中心大值与个小值之间的距离：
r 横向 = 1.22λ/（2•na）= 0.6λ/ na
其中λ是发射光的波长，na是物镜的数值孔径。
显微镜中的分辨率与显微镜的点扩散函数的fwhm尺寸直接相关，为了避免在艾里斑中鉴定大强度的困难，通常通过实验测量该值。利用点扩展函数的fwhm值进行的分辨率测量要比采用瑞利准则计算的分辨率稍小。此外，在共聚焦荧光构造中，采用逐点照明扫描和逐点检测，使得仅能够检测在照明和检测点扩散函数的共享体积中的荧光团。因此，在共焦情况下，强度点扩展函数是独立照明强度和检测强度点扩展函数的乘积。对于共聚焦荧光，与宽视野显微镜相比，点扩散函数的横向（和轴向）范围减小了约30％。由于强度点扩散函数较窄，因此在共聚焦显微镜中产生可接受的对比度所需的点分离减少到以下距离：
r 横向 = 0.4λ/ na
如果照明和荧光发射波长大致相同，则共聚焦荧光显微镜艾里斑的大小就是宽视野显微镜艾里斑的平方。因此，在共焦布置中，对比度截止距离减小了，并且与宽场照明配置相比，可以在更短的距离上实现等效对比度。无论仪器配置如何，横向分辨率都与波长成比例关系，并且与物镜数值孔径成反比。
如前所述，横向分辨率是讨论分辨率和对比度的主要关注点，尽管与宽场荧光配置相比，共焦配置中显微镜强度点扩展函数的轴向范围也有所减少。当点状物体被轴向点扩展函数分量的中心大值和小值之间的距离分开时，会在位于光轴上的点状对象之间产生合理的对比度。图3所示为典型的宽视野（图3（a））和共焦（图3（b））荧光显微镜的轴向强度分布。请注意，共焦分布中“翼”的强度显着降低，这是距中心大值的距离的函数。
文献中提出了各种方程式，这些方程式与用于计算各种显微镜配置的轴向分辨率的不同模型有关。于荧光发射的方法在形式上类似于评估景深的表达式，并证明轴向分辨率与样本介质的波长和折射率成正比，与数值孔径的平方成反比。因此，与发射波长相比，显微镜物镜的数值孔径对轴向分辨率的影响要大得多。下面给出了一个通常用于描述共焦结构的轴向分辨率的方程，其中η代表折射率，其他变量如前所述：
r 轴向 = 1.4λ• η / na2
尽管共聚焦显微镜的配置仅比宽视场显微镜在轴向分辨率上有适度的提高，但是共聚焦方法的真正优势在于厚样品的光学切片能力，与常规方法相比，有效的轴向分辨率有了显着提高技术。共聚焦显微镜的光学切片特性是由积分强度点扩展函数的特性决定的，当根据深度进行评估时，该函数在焦平面中具有大值。传统广角显微镜的强度点扩展函数的等效积分是深度的常数，因此没有光学切片功能。
影响对比度的实际因素
共聚焦显微镜在当前生物学和生物医学研究中的重要性主要来自光学切片功能，该功能可对厚样本进行三维分析，例如在涉及活细胞和组织的研究中遇到的样本。光学切片特性是通过使用点状照明和检测配置而产生的，该点状照明和检测配置将相关的共焦观察体积限制在照明和检测体积的重叠区域。为了增加感兴趣的特征的分辨率，采用了各种策略来减小该体积。常规阿贝理论描述了可以修改以提高横向分辨率的参数之间的相互作用，包括减小入射光的波长，增加标本介质的折射率，并增加光学系统的接收角（数值孔径）。其中的前两个经常受到给定实验对可使用的荧光团的要求以及保持标本生存能力的限制。
即使具有更高的数值孔径物镜，共焦针孔的使用也会将照明和检测光路限制在光学系统大立体角的很小一部分，从而导致沿光轴的点扩散函数延长。额外的研究工作已经导致了许多实验技术，以减少这种对轴向分辨率的限制，以及各种其他因素的影响，例如引入光学像差的折射率失配。在用于小化该问题的方法中，使用了高数值孔径的水浸物镜。
实现理想光学性能的许多实际限制的意义在于，不应误解传统的阿贝分辨率计算来描述显微镜的分辨率。衍射极限预测的分辨率与条件有关，包括无限的信噪比。荧光显微镜实际上受光子产量低的限制，并且要求激发与发射光子的比率通常在数百万之内。因为即使在高照明水平下，分辨率也需要一定的对比度，并且对比度受信噪比的影响，所以实际上达到的对比度水平终取决于检测到的光子数量。
除了收集的光子数量和各种光学像差外，采样过程本身是数字显微镜的基本特征，它在荧光共聚焦显微镜中起着决定对比度和分辨率的作用。如前所述，数字共焦图像不仅必须记录，而且必须在离散的像素内处理和显示，这一事实引入了成像变量，而对于数字成像新手来说，显微学家可能不熟悉这些成像变量。此外，像素化，或将图像划分为有限的图片元素，是在成像过程的几个阶段进行的，并且这些步骤必须彼此交互才能将图像信息从样本转移到终的可视图像显示。这些离散元件在各个阶段之间不匹配的可能性是另一个可能限制图像对比度和分辨率的因素。
有时会根据转盘来描述显微镜光学系统在标本级别施加的分辨率，这是小的光学可分辨元素。取决于用来定义两个元素之间的可检测强度差的标准，卷轴的大小可以对应于瑞利极限，麻雀极限或其他任意定义。通过采样对应于样本中点状特征的艾里图案，像素化或数字化的效果初会以光学分辨率级别显示在成像序列中。分区或像素化也发生在成像过程的显示阶段，并且已发表文献中术语使用的差异会导致在讨论整个成像序列各个阶段发生的数字化过程时产生混乱。术语resel术语“样品”是指标本（物体）的小区域，该区域可以与相邻区域区分开，而无需考虑随后的检测，处理或显示。在三维共聚焦成像中，尽管没有理由将转轴的概念限制为二维，但有时将体积分辨率元素称为体素，并且该术语可用于描述小空间分辨元素（在二维或三维上），由显微镜系统的光学元件确定。
图4说明了一种机制，通过该机制对紧密排列的艾里图案的强度进行采样的过程会降低图像对比度。通常假定艾里图案是由无数个样本（或数据点）描述的平滑连续函数，如整个图案上强度变化的典型模拟表示所示。当视为连续函数时，艾里图案会显示出它们的全部强度变化，并在给定的分隔距离下产生大的理论对比度。例如，如果通过扫描仪或数字成像设备将其划分为有限数量的测量点或区域，则平滑曲线将转换为一系列强度值，每个强度值都可以存储在计算机存储位置中。通过离散采样
每个像素平均或汇总区域内光学系统的强度响应。由于艾里函数过零发生在点而不是区域上，因此对于任何有限的像素大小，像素值都不能为零。类似地，通过面积平均来减小测得的强度峰值的大值，并且增大小值和减小大值的组合效果是减小对比度。因此，像素化过程会增加截止距离，降低分辨率（对于任何对比度标准）。此外，如果相对于转盘尺寸的像素尺寸太大，则在图像平面中的强度响应的小值和大值的位置引入模糊性。
不可避免的是，光学系统中固有的分辨率没有被检测器充分采样，这会丢失。随着更多像素用于描述强度变化，像素化的影响已降至低。几种检测器设计获取像素化数据作为检测器的固有属性（例如ccd摄像机），而其他检测器设计则需要在检测之后通过模数转换器或类似数字转换器将连续的模拟信号数字化。利用单个检测通道的共聚焦激光扫描系统的线扫描以这种方式操作。像素大小与airy圆盘直径的关系决定了对两个相邻的airy圆盘进行采样以达到一定对比度所需的像素数。
确定拍摄图像的对比度和分辨率时，实际需要考虑的另一个因素是强度分辨率，它决定了分配给每个图像像素的亮度值。类似于转盘，转盘的大小由系统的光学特性决定，可以分辨的小可检测强度差取决于检测器的电子特性，尤其是其信噪比。当转移到图像输出级时，每个像素的亮度由灰度表示以及表示亮度的精度取决于所用灰度级的数量与检测器测得的小可检测强度差之间的关系。当由计算机存储时，与图像中空间位置相对应的每个像素都有一个相关的强度值，用于8位存储（256个灰度级），范围从0到255。在共聚焦显微镜中，检测分辨率很少证明使用超过256个灰度级是合理的，尽管对于某些数据处理算法来说，在区分更多强度级时可能会有一些价值。
重要的是要认识到图像显示阶段的像素化并非数字成像所*。某种形式的“颗粒度”是每种类型的图像表示中固有的，并且对颗粒的大小和组织的操纵被用来表示所需的灰度级范围。摄影胶片具有各种尺寸的银粒，电视显示器是离散的水平线的阵列，每条水平线均显示基于电子带宽的强度变化，并且半色调打印技术将黑白点分成各种尺寸的像素以模拟连续的色调变化。即使在每个像素使用一个点的情况下，视频监视器也能够改变每个显示点的强度并实现一些色调变化。然而，为了表示足够数量的灰度以产生连续色调图像的视觉效果或显示颜色变化，必须分配多个点来表示每个像素。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。为了显示颜色变化，必须分配多个点来表示每个像素。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。为了显示颜色变化，必须分配多个点来表示每个像素。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。基于胶片的摄影方法将多个银颗粒分配给每个图像转盘，以提供足够的强度范围，以产生连续的色调变化。在所有这些方法中，由于将更多基本点或图像元素组合在一起以实现更大的色调范围，因此图像的外观变得更“粒状”，从而降低了视在分辨率。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。降低视在分辨率的效果。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。降低视在分辨率的效果。必须根据成像要求考虑并平衡像素大小和显示更大灰度范围的能力之间的反比关系。
所有数字共聚焦显微图像都是在离散分区或像素的领域中获取，处理和显示的，而不是被视为标本数据的连续表示，这一事实不是具有根本意义的问题，而是一个成像技术的实际问题。只要显微镜根据适用的采样理论进行操作，该显微镜决定了以足够的对比度复制感兴趣的特征所需的空间或时间的采样间隔，就没有明显的限制。通常依赖的采样标准基于*的奈奎斯特定理，它了忠实地重构纯正弦波所需的采样间隔，该间隔是其频率的函数。实践中的问题是，在典型的共聚焦显微镜上使用变焦放大倍率控件很容易以违反奈奎斯特标准的方式被滥用。
奈奎斯特采样理论的应用通常是通过考虑空间频率而不是物体大小域中的样本特征来解释的。实际上，每个空间单位的对象数量（频率）与对象大小成反比，并强调了样本特征之间的间距在图像形成中的重要性。空间频域的使用与基于光学系统在传输不同频率的图像信息时保持对比度（和可见性）的能力来评估性能的实践相一致。所有光学系统都会降低成像过程中的对比度，并且对于较高的空间频率（较小的间距），此效果在较低的频率（较大的间距）下更为严重。对比度传递函数（ctf的光学系统的）是通过绘制的由具有交替的黑暗和光棒在一个频率范围内，或配置间隔周期排列的测试图案的图像中的测量对比度构成。图5展示了一个光学系统的假设ctf，其中包括系统对具有黑条和白条（对比度为100％）的测试目标以及由灰条和白条组成的目标仅产生30％对比度的系统响应的曲线。
检查图5的对比度传输曲线可以清楚地说明分辨率和对比度之间的相互依赖关系，以及一些常见假设的问题，这些假设将分辨率视为仪器性能的常数。分辨率是一个有点随意的变量，仅在其他相关因素的框架内考虑时才有意义。当定义为产生一定对比度的空间频率时，很容易假定具有分辨率范围内的频率的任何特征都是同等可见的，而实际上原本具有高对比度的标本特征要比那些具有高对比度的标本特征更清晰可见。在每个频率下降低对比度，直至对比度截止频率。曲线（图5）说明，由于染色特性或其他因素，初具有30％对比度的标本特征在空间频率接近理论极限的任何地方都不会保持瑞利的26％对比度，假设对比度相等在所有频率上达到分辨率极限。在稍稍处于分辨率极限之内的小特征的对比度产生的对比度比大特征的对比度要低得多，因为每个大特征均已被成像系统的传递函数降低。
样本特征在显微镜图像中的可见性取决于特征相对于其周围环境的对比度，在对比度传递函数中反映的光学系统的性能，信噪比统计以及信号的方式被采样以进行数字化。奈奎斯特（nyquist）发现，为了忠实地重建纯正弦波，必须在该波的每个周期内至少采样两次，或者以两倍于时间频率的频率对其采样。成像中感兴趣的频率具有空间性质，但是奈奎斯特定理同样适用于此类数据。显微成像应用中采用的小采样频率通常是要重建的大频率的2.3倍。使用值2.3（而不是2）
在图像重建之前应用于采样数据的低通滤波类似于眼睛和大脑进行的“滤波”，以平滑像素化的数据（例如半色调图像）或远离显示器（例如，大屏幕电视，以消除可见的扫描线。低通滤波可消除与数据无关的采样伪像，并有助于使图像显得连续。理想的滤波器将允许以频率2倍的频率进行采样，但是由于不存在此类设备，因此经验得出的普遍性是，以频率2.3倍的采样率足以满足实际滤波器的性能（通常是积分器数模转换器）。
在显微镜的实际操作中，估计样本中应关注的频率时通常会存在一些不确定性。许多标本具有清晰的边缘，并且具有许多微小的特征，这些特征为信号提供了*的频率成分。由光学元件施加的艾里强度分布函数或高斯分布会使这些成分模糊到一定程度，以致细节仅出现在光学分辨率极限之内。尽管没有必要在较高的频率下采样，但未能对所有低于该极限的频率分量进行采样会产生图像误差，这将不再带来样本信息（在光学传输后，见图6）。在某些情况下，应从2以上取样。信息频率的3倍，以允许错误估计频率。在共聚焦激光扫描显微镜中，要采样的频率（f）由光学系统施加，并且对于特定的分辨率规格：
f = 1 / r（分辨率）
为了保留由光学系统传输到显微镜的采样（数字化）台的所有信息，并具有对比度传输功能（如图5所示），像素大小必须小于2.3倍的倒数。截止频率（f 截止）：
像素尺寸截止
在实验所施加的限制范围内，要准确地表示样本特征，需要使用空间采样频率和电子属性（例如带通），这些属性必须与系统的光学分辨率相匹配。在共聚焦显微镜中，光学分辨率（转盘大小）主要取决于光的波长和物镜的数值孔径。显微镜上的缩放控件提供了将像素大小与光学特性进行匹配的能力，并满足了以至少两倍于标本信号空间频率的两倍来获取样品的奈奎斯特准则。通常，缩放控件会更改样本上扫描区域的大小，但不会更改采样像素的数量。因此，像素大小与缩放系数成反比。对于波长，数值孔径和物镜放大倍率的特定组合，只有一个的缩放设置：当参考标本空间时，该设置可提供与奈奎斯特标准匹配的像素大小。在除变焦设置以外的其他条件下，根据像素大小是否会导致两个不同的成像问题，数据的过采样或欠采样（图6）。
当在高于对应于奈奎斯特条件的显微镜的变焦设置下操作时，在标本上会生成较小的像素，从而在缩小的扫描区域内对数据进行过采样。以比光学分辨率所需的像素尺寸小的像素尺寸进行采样不仅会使标本遭受比所需的更严重的光致漂白，而且还会减少在给定时间内可以扫描的区域。有时认为以比对应于奈奎斯特极限的频率高得多的频率对标本特征进行采样很有用，以便获得有关特征位置的信息。以这种方式进行操作会产生称为超采样的情况，其中未解析物体的位置可能比显微镜光学分辨率所能提供的精度更高。尽管没有提供有关样本特征的详细信息，超出了转盘尺寸所允许的范围，但可以从模糊图像的强度分布中确定其位置。如果特征是由大量像素采样的，并且对于这种过采样所暗示的高光子通量是稳定的，则光斑的质心就可以在信号噪声所施加的限制范围内确定其位置。
样本数据欠采样会导致另一种类型的问题。与过采样的情况一样，这种情况是由成像序列的分配机制中的不匹配引起的。这种不匹配发生在采样频率和转盘大小（分辨率）之间，并且涉及数据中的空间频率，该空间频率高于可以由采样率准确表示的空间频率。欠采样通常发生在较低的显微镜变焦设置下，其像素大小大于奈奎斯特标准的像素大小。除了采样*遗漏了较小的特征外，其他特征可能会出现在图像中，而样本中没有这些特征。这种现象可能是由于称为混叠的过程引起的，其中标本特征在图像中所呈现的特征与标本中所呈现的特征*不同。实际上，它们以“别名”或错误身份出现，并且经常被伪装成样本中不存在的空间频率。
该过程在图7中进行了说明，其中以每微米2个频率对3微米频率的样本特征进行采样。样本分割会丢失样本数据的整个周期，并输出样本中不存在的每微米1的信号。混叠图像是由解析数据和检测器特性之间的欠采样不匹配导致的。当像素过大而产生的所谓“盲点”错过了实际特征时，混叠可能会导致出现比标本更大，更小或位置不同的特征。一旦发生采样，就无法确定哪些图像特征是真实的，哪些图像是伪像。
在如图7所示的情况下，由于无法在选定的采样率下准确呈现此尺寸的样本特征，因此必须提高采样率，或者应采用某种形式的过滤以消除超出系统可以处理的那些（超出奈奎斯特限制的那些）。每微米大于6个循环的采样将满足nyquist标准，并准确地重现样本特征，但是，如果不可能，则在大多数情况下，实际的解决方案是调整显微镜的缩放设置，以使采样与解决机制。如果无法获得足够数量的像素以正确表示样品特征，则分辨率应受到限制或降低，
限制光学分辨率的一种常用方法是采用较小的数值孔径光学组件，或者对物镜的后焦平面进行底部填充以减小其有效数值孔径。这种方法的主要缺点是，它降低了光收集效率，并且因此增加了样品曝光时间（用于图像采集），因此有可能对敏感样品造成更大的损害。降低分辨率以匹配采样属性的另一种机制是利用较大的针孔直径（或其他光学方法）来将源盘的有效大小增加到超出衍射限制的光斑大小。该技术的优点是线性地降低了横向分辨率和轴向分辨率，而数值孔径的变化会二次影响轴向分辨率。在任一情况下，共聚焦显微镜保留了其光学切片功能和*的采样灵活性。此外，通常建议在使用检测系统（例如单通道光电倍增管）时（其中信号的像素化不是检测器固有的），采样分辨率也应通过电子方式降低。对于给定的采样率，可以在模数转换器之前采用积分器，以将信号电压的采样限制为奈奎斯特的速率。采样分辨率也应通过电子方式降低。对于给定的采样率，可以在模数转换器之前采用积分器，以将信号电压的采样限制为奈奎斯特的速率。采样分辨率也应通过电子方式降低。对于给定的采样率，可以在模数转换器之前采用积分器，以将信号电压的采样限制为奈奎斯特的速率。
能够以与样本和荧光团特性一致的光斑尺寸，并适合实验要求的显微镜操作显微镜，这一点很重要。理想情况下，该仪器应能够在衍射极限配置和较大光斑尺寸下运行。在许多实验情况下，都希望通过打破与焦斑大小，针孔直径和采样频率有关的规则，以低于其衍射极限的分辨率有意操作显微镜，但操作员应始终注意证明这些偏差的情况。
SOR液位开关的接线方法，怎样接正确
喷淋塔废气处理设备解决方案
闭孔B1级橡塑保温板生产厂家
U44SM弹性密封圈不锈钢角式柱塞阀
煤电厂为什么要检测氯乙烯气体？
共聚焦显微镜的分辨率和对比度
COD检测仪如何准确检测水样呢?
数控立式车床加工工艺的注意事项
揉面机应该如何进行选择呢？
keysight 86038B 光色散和损耗分析仪 深圳市美佳特
用适当的方法予以修复PH电极
ZG系列振动给料机 ZG-40-130F振动给料机 GZG电机振动给料机
旋转流变仪的使用及原理
山东角度带锯床锯条断裂问题解析
电缆现场修补应注意哪些问题
蒸汽流量计的故障排除方法
ANDA 在萨尔瓦多安装LG Sonic MPC-Buoy(超声波除藻仪) 系统以保障供水
德国moenninghoff电磁齿轮联轴器性能要求
SDF-2型（隧道法）防火涂料测试仪四个功能有
冷水机设备的应用领域