RNA制备中常见问题和解答
rna制备中常见问题和解答
1、塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(a)塑料制品：尽可能使用无菌,一次性塑料制品.已标明rnase-free 的塑料制品,如没有开封使用过,通常没有必要再次处理.对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用.处理方法如下：
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入depc使depc的终浓度为0.1%.注意：depc为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用.
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入depc水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中.
(3)在通风柜中室温处理过夜.
(4)将depc水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已depc水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟.
(5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥.置于干净处备用.
(b)玻璃和金属物品
250°c烘烤3小时以上.
2、rnase 是rna制备的杀手
答：rnase酶非常稳定,是导致rna降解zui主要的物质.它在一些的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性.用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是rnase*失活.它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与rna制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套.rnase的又一污染源是取液器.根据取液器制造商的要求对取液器进行处理.一般情况下采用用depc配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求.取 rnase-free的物品时必须戴手套.
3、采用什么方式纯化总rna？
答：我们提供多种rna纯化方式,根据您对rna纯化技术的熟悉程度,选用不同的纯化手段.从产品使用效果看,基于triblue的一步法分离总rna试剂盒（k311,k321系列）无论是新手还熟手都可以得到比较理想的结果.如果您对*过敏,出于对环境的保护,您可以选用整个分离流程都不使用*的试剂盒（k361系列）.从产品形式上,我们的总rna分离分醇沉淀离心式和离心吸附柱方式两种.沉淀方式总的产量比较高,纯化规模机动,但是纯度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比较简单,纯度高,受吸附容量的影响,产量收到影响.
4、什么时候需要分离mrna?
答：常规rt-pcr鉴定基因表达水平的,一般都可以采用总rna作为rt-pcr 的模板,但是做cdna文库,克隆丰度极低的基因,大多数dd-pcr, 削减杂交等需要纯化的mrna.一般用oligo (dt)-cellulose或在磁珠上偶连oligo (dt),从组织或总rna种直接分离mrna.
5、如何判定分离的总rna的纯度？
答：需要从两个方面着手,缺一不可,特别是新手（1）测定od260/od280的比值,测定时,rna需要用10mm tris-hcl,ph7.5稀释.理想的rna, od260/280在1.9-2.1之间.比值如果过低,可能有蛋白质污染,过高rna可能已发生降解.（2）琼脂糖变性电泳观察rrna的完整性和强度.变性电泳需要采用mops系统,不可以采用dna 电泳用的tbe或tae系统.如果od260/od280过低（<1.7）,通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现.
6、什么时候需要加入rna-carrier?
答：样品很少或样品中rna含量低,制备rna时需要加入一定的 rna载体,以提高rna纯化的得率.常用的载体有polyacryl carrier, poly a, poly c和glycogen.一定浓度范围的 carrier对一些rna的下游应用没有影响,如rt-pcr, northern blot.
7、如何除去纯化的rna中微量的基因组dna?
答：无论用种方式制备的总rna,要保证不含基因组dna是不现实的.如果您希望得到dna free 的rna样品,需要用rnase free的dnase i处理.
8、纯化的rna样品如何保存？
答：如果希望得到*的结果,纯化的rna需要立即用于下游实验.rna可以保存在-80c冰箱,*保存可以置于液氮中.如果没有-80冰箱或液氮,rna也可以保存在异丙醇或乙醇中,-20度保存.
9、组织和细胞样品如何收集,保存？
答：组织样品收集后,需要立即保存在液氮中,或在样品中加入一定量的保护剂,有一些商业化的产品可以选用.一般实验收集50-100mg组织就足够了.
10、如何估计rna的产量？
答：能计算出rna的产量,通常都是有比较多的起材料,但是很多情况下能够取得材料很少,所制备得到的rna无法通过分光光度的方法测定含量和浓度.rna的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关,例如用抽提小鼠组织100mg 肝可以得到500ug总rna, 100mg肺 得到200ug总rna, 1百万个细胞hela细胞可以得到15ug左右的总rna. mrna的含量一般占总rna含量的2-5%.根据这样一些经验值,估算出您可能得到的量.样品如果低于20mg或10000个细胞,在抽提时需要考虑加入合适的rna沉淀载体.
11、rna制备过程中那个环节要特别注意？
答：一般情况下,细胞和组织在rna抽提液中都可以保存一段时间,因为几乎所有的rna的抽提裂解液中都含有高浓度的异硫氰酸胍等强变性剂, rnase基本是不起作用的,操作即使是粗放一些,也没有多达关系.但是通常是离心后取上清,这时候rna已没有保护,操作要特别小心.
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(1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入depc使depc的终浓度为0.1%.注意：depc为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用.
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入depc水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中.
(3)在通风柜中室温处理过夜.
(4)将depc水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已depc水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟.
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2、rnase 是rna制备的杀手
答：rnase酶非常稳定,是导致rna降解zui主要的物质.它在一些的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性.用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是rnase*失活.它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与rna制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套.rnase的又一污染源是取液器.根据取液器制造商的要求对取液器进行处理.一般情况下采用用depc配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求.取 rnase-free的物品时必须戴手套.
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4、什么时候需要分离mrna?
答：常规rt-pcr鉴定基因表达水平的,一般都可以采用总rna作为rt-pcr 的模板,但是做cdna文库,克隆丰度极低的基因,大多数dd-pcr, 削减杂交等需要纯化的mrna.一般用oligo (dt)-cellulose或在磁珠上偶连oligo (dt),从组织或总rna种直接分离mrna.
5、如何判定分离的总rna的纯度？
答：需要从两个方面着手,缺一不可,特别是新手（1）测定od260/od280的比值,测定时,rna需要用10mm tris-hcl,ph7.5稀释.理想的rna, od260/280在1.9-2.1之间.比值如果过低,可能有蛋白质污染,过高rna可能已发生降解.（2）琼脂糖变性电泳观察rrna的完整性和强度.变性电泳需要采用mops系统,不可以采用dna 电泳用的tbe或tae系统.如果od260/od280过低（<1.7）,通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现.
6、什么时候需要加入rna-carrier?
答：样品很少或样品中rna含量低,制备rna时需要加入一定的 rna载体,以提高rna纯化的得率.常用的载体有polyacryl carrier, poly a, poly c和glycogen.一定浓度范围的 carrier对一些rna的下游应用没有影响,如rt-pcr, northern blot.
7、如何除去纯化的rna中微量的基因组dna?
答：无论用种方式制备的总rna,要保证不含基因组dna是不现实的.如果您希望得到dna free 的rna样品,需要用rnase free的dnase i处理.
8、纯化的rna样品如何保存？
答：如果希望得到*的结果,纯化的rna需要立即用于下游实验.rna可以保存在-80c冰箱,*保存可以置于液氮中.如果没有-80冰箱或液氮,rna也可以保存在异丙醇或乙醇中,-20度保存.
9、组织和细胞样品如何收集,保存？
答：组织样品收集后,需要立即保存在液氮中,或在样品中加入一定量的保护剂,有一些商业化的产品可以选用.一般实验收集50-100mg组织就足够了.
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11、rna制备过程中那个环节要特别注意？
答：一般情况下,细胞和组织在rna抽提液中都可以保存一段时间,因为几乎所有的rna的抽提裂解液中都含有高浓度的异硫氰酸胍等强变性剂, rnase基本是不起作用的,操作即使是粗放一些,也没有多达关系.但是通常是离心后取上清,这时候rna已没有保护,操作要特别小心.
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