在线固相萃取非抑制离子色谱法测定婴儿配方奶粉中的左旋肉碱
左旋肉碱（l-carnitine, β-羟基γ-*铵丁酸）又称肉毒碱或维生素 bt，其化学式为c7h15o3n，分子量为162.2，是一种类氨基酸。l-肉碱作为 载体将长链脂肪酸从腺粒体膜外输送到膜内，促进脂肪酸的β-氧化，从降低 血清*及甘油三脂的含量，提高机体耐受力及减少代谢毒性作用[i-iv]。对 婴幼儿来说，l-肉碱在维持婴幼儿生命及许多促进发育的生理过程，如生酮 作用、蛋白质代谢等方面均有一定的功能[v,vi]。我国及许多其它已规定在 婴幼儿食品配方中添加适量的l-肉碱，以满足其生理需要，更好地促进婴幼 儿健康成长[vii-x]。
左旋肉碱极性较强，缺少发色基团，定量分析困难。国内外对左旋肉碱 的测定主要有酶法[xi,xii]、电泳[xiii,xiv]、流动相注射串联质谱法[xv]，液相色谱 法[xvi-xix]等。酶法专属性强，但前处理繁琐，液相色谱法中低波长检测则 干扰较多，衍生法灵敏度高，但前处理复杂，所用衍生剂毒性强。其它方法 有的灵敏度较低。有的设备较贵等原因较少使用。
离子色谱法可测定在水溶液中能电离的物质。在酸性溶液中，左旋肉碱 表现为阳离子特性，带正电荷，可用阳离子交换色谱柱分离。但左旋肉碱的 两性特征使其在抑制后呈电中性，无法采用抑制型电导检测。同时，奶粉中 左旋肉碱添加量较低，需要更低检出限的测定方法。为此，我们通过实验， 摸索出左旋肉碱的在线固相萃取非抑制型离子色谱测定的新方法。该方法前 处理简便、检测快速，用于奶粉样品中左旋肉碱的检测，结果令人满意
测试条件
仪器：赛默飞戴安ics系列离子色谱系统带双六通阀及双泵。 分析柱: ionpac cs17 + ionpac cg17，4 mm 浓缩柱: ionpac tcc-upl1 msa：0-20 min，3 mm；流速：1 ml/min 柱温：30 ℃
检测方式：抑制型电导检测
进样量：500 µl
样品前处理
称取奶粉样品约1 g至50 ml比色皿中，加入超纯水 14 ml，适当摇晃，使奶粉充分溶解后加入21 ml乙腈沉淀蛋白，静置10 min，取上层清液，10000 r/min离心 10 min后，稀释5倍，将稀释液依次通过0.22 µm尼龙滤膜 和onguard ii rp柱、na柱，弃去6 ml初始流出液后采集 2 ml样品用于离子色谱测定。 onguard ii rp柱（规格2.5 cc），预先使用10 ml甲 醇和15 ml水活化。 onguard ii na柱，用10 ml水活化。
结果与讨论
1. 前处理条件的选择
奶粉配方比较复杂，含有大量蛋白质、糖和盐。如 果奶粉中的蛋白质不经去除而直接进入色谱柱，则可能 吸附在色谱柱上，导致色谱柱柱效降低甚至失效。沉淀 蛋白质的常用方法有重金属盐沉淀法、酸沉淀法、有机 溶剂沉淀法等。人为引入金属盐会导致去除成本升高， 去除不干净可能导污染色谱柱而使色谱柱失效。如果采 用酸沉淀法，会引入大量氢离子，对左旋肉碱出峰产生 干扰。因此，这两种方法在本试验中均不考虑。采用加 入乙腈沉淀蛋白的方法，沉淀蛋白效果较好，可得到 澄清的上层溶液。通过在1 g奶粉中加入1 ml、2 ml、 5 ml、10 ml、14 ml的高纯水来溶解奶粉，发现如果加 入水的量过少，则奶粉溶解不充分，考虑到检出限的限 制，我们用14 ml高纯水来溶解1 g奶粉样品。用乙腈来沉 淀蛋白，乙腈的量是需要考虑的重要因素。在14 ml的奶 粉样品中加10 ml、14 ml、18 ml、21 ml、24 ml的乙 腈，发现如果乙腈的加入量小于水的量，则蛋白沉淀不 *，大量蛋白悬浮于溶液中，无法沉淀。随乙腈加入 量加大，沉淀蛋白速度加快，上层液更加澄清。考虑成 本因素，终确定加入乙腈量为21 ml。即可使蛋白沉淀 *，又不至于溶液中有太高比例的乙腈，导致浪费和 后续处理困难。 稀释5倍的提取液依次通过rp柱和na柱进行净 化。用rp柱可除去疏水性的脂肪等物质，na柱作为阳离 子交换柱，可除去钾、钙等阳离子，避免可能的干扰。
2. 阀切换条件的确定
进样后，将阀切换到浓缩柱一边，用纯水将样品冲入 浓缩柱，这时，残留的阳离子及左旋肉碱浓缩在柱上，乙 腈被冲出。5分钟后，乙腈被冲洗干净。再将阀切换到分离 柱侧，左旋肉碱在色谱柱上得到分离。比较了不同时间纯 水的冲洗效果，5分钟比较合适，可将乙腈及其它无保留杂 质冲洗干净。阀切换配置图如图1所示，切换程序见表1。
3. 色谱柱的选择 因为是非抑制电导检测，所以为了降低噪音，需要 选择低淋洗强度淋洗液就能洗脱的离子交换柱。在戴安 产品中符合要求的柱子有ionpac cs17、 ionpac cs18 （6.0 µm, 250 mm×2 mm）、ionpac scs1三种不同色 谱柱。实验发现，ionpac scs1柱亲水性差，左旋肉碱的 峰形不好。ionpac cs17、 ionpac cs18都是很低疏水性 的柱，左旋肉碱的峰形对称性好。但实际样品测试的时 候，ionpac cs18柱上左旋肉碱被不明峰干扰。因此，选 择cs17 + cg17作为分析l-左旋肉碱的色谱柱。
4. 淋洗液浓度的确定
依次选用6、5、4、3、2 mmol/l的甲基磺酸，测定 奶粉中左旋肉碱的色谱分析特征，确定合适的淋洗液浓 度。结果表明：随淋洗浓度从6 mmol/l降低到2 mmol/ l，背景电导从2231 us降低至777 us，噪声降低，理 论塔板数提高，各成分间的分离度增大，峰形改善，信 噪比从12增大至67.8，但保留时间也从6.91 min增大至 15.51 min。。综合考虑，我们选择3 mmol/l的甲基磺酸 作为分析用淋洗液。在优化的淋洗液浓度下，标准样品 及真实样品的左旋肉碱色谱图如图2所示。
5. 干扰因素
通过在前处理时加入钠柱，去除镁、钙、钾、铁、 铜、锰、锌等阳离子，避免干扰左旋肉碱。干扰电导响 应的乙腈，也已经在切换浓缩过程被纯水冲出浓缩柱， 因此不会干扰左旋肉碱的检测。
6. 检出限与线性范围
按实验方法在选定的色谱条件下，对左旋肉碱进行 线性和检出限测定。取标准工作液，以高纯水稀释成 0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mg/l，用离子色谱进行 检测，以峰面积y对质量浓度x（mg/l）进行作图，得回 归方程y=0.686x-0.006。线性范围17.5 mg/kg～175 mg/ kg，相关系数r>0.9995。取标准工作液，以高纯水稀释 成0.01、0.02、0.03、0.04 mg/l，按优化条件进行处理 后，以信噪比（s/n）≥3的低浓度作为奶粉中左旋肉 碱的检出限，测得左旋肉碱检出限为5 mg/kg。
7. 精密度与回收率
按实验方法，取市售奶粉样品进行不同浓度加标试 验，连续进样5次，测定左旋肉碱平均回收率和精密度， 结果列于表2，该方法的回收率在92.3%～105.2%之间， rsd在1.4%～4.3%之间。
实际样品分析:
按实验方法，惠氏膳儿加产品包装上左旋肉碱标示 含量为7.7 mg/100 g、本文所测结果与之接近。惠氏爱儿 乐和伊利奶粉包装上未标识添加有左旋肉碱，但本试验 依然检出，这可能与天然奶源中就含有一定量左旋肉碱 有关。
结论
采用阀切换-非抑制型离子色谱法来测定奶制品中的 左旋肉碱，具有简单、快速、干扰少、环保等特点。相 比常见的其它测试方法，避免了繁琐的前处理，无需衍 生化，节约时间，重复性好，检出限能满足要求。该方 法可用于奶粉中左旋肉碱的含量测定。
但本方法也有不足，即无法区分左旋肉碱和右旋肉 碱，这是作者仍需继续研究的课题之一。
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测试条件
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进样量：500 µl
样品前处理
称取奶粉样品约1 g至50 ml比色皿中，加入超纯水 14 ml，适当摇晃，使奶粉充分溶解后加入21 ml乙腈沉淀蛋白，静置10 min，取上层清液，10000 r/min离心 10 min后，稀释5倍，将稀释液依次通过0.22 µm尼龙滤膜 和onguard ii rp柱、na柱，弃去6 ml初始流出液后采集 2 ml样品用于离子色谱测定。 onguard ii rp柱（规格2.5 cc），预先使用10 ml甲 醇和15 ml水活化。 onguard ii na柱，用10 ml水活化。
结果与讨论
1. 前处理条件的选择
奶粉配方比较复杂，含有大量蛋白质、糖和盐。如 果奶粉中的蛋白质不经去除而直接进入色谱柱，则可能 吸附在色谱柱上，导致色谱柱柱效降低甚至失效。沉淀 蛋白质的常用方法有重金属盐沉淀法、酸沉淀法、有机 溶剂沉淀法等。人为引入金属盐会导致去除成本升高， 去除不干净可能导污染色谱柱而使色谱柱失效。如果采 用酸沉淀法，会引入大量氢离子，对左旋肉碱出峰产生 干扰。因此，这两种方法在本试验中均不考虑。采用加 入乙腈沉淀蛋白的方法，沉淀蛋白效果较好，可得到 澄清的上层溶液。通过在1 g奶粉中加入1 ml、2 ml、 5 ml、10 ml、14 ml的高纯水来溶解奶粉，发现如果加 入水的量过少，则奶粉溶解不充分，考虑到检出限的限 制，我们用14 ml高纯水来溶解1 g奶粉样品。用乙腈来沉 淀蛋白，乙腈的量是需要考虑的重要因素。在14 ml的奶 粉样品中加10 ml、14 ml、18 ml、21 ml、24 ml的乙 腈，发现如果乙腈的加入量小于水的量，则蛋白沉淀不 *，大量蛋白悬浮于溶液中，无法沉淀。随乙腈加入 量加大，沉淀蛋白速度加快，上层液更加澄清。考虑成 本因素，终确定加入乙腈量为21 ml。即可使蛋白沉淀 *，又不至于溶液中有太高比例的乙腈，导致浪费和 后续处理困难。 稀释5倍的提取液依次通过rp柱和na柱进行净 化。用rp柱可除去疏水性的脂肪等物质，na柱作为阳离 子交换柱，可除去钾、钙等阳离子，避免可能的干扰。
2. 阀切换条件的确定
进样后，将阀切换到浓缩柱一边，用纯水将样品冲入 浓缩柱，这时，残留的阳离子及左旋肉碱浓缩在柱上，乙 腈被冲出。5分钟后，乙腈被冲洗干净。再将阀切换到分离 柱侧，左旋肉碱在色谱柱上得到分离。比较了不同时间纯 水的冲洗效果，5分钟比较合适，可将乙腈及其它无保留杂 质冲洗干净。阀切换配置图如图1所示，切换程序见表1。
3. 色谱柱的选择 因为是非抑制电导检测，所以为了降低噪音，需要 选择低淋洗强度淋洗液就能洗脱的离子交换柱。在戴安 产品中符合要求的柱子有ionpac cs17、 ionpac cs18 （6.0 µm, 250 mm×2 mm）、ionpac scs1三种不同色 谱柱。实验发现，ionpac scs1柱亲水性差，左旋肉碱的 峰形不好。ionpac cs17、 ionpac cs18都是很低疏水性 的柱，左旋肉碱的峰形对称性好。但实际样品测试的时 候，ionpac cs18柱上左旋肉碱被不明峰干扰。因此，选 择cs17 + cg17作为分析l-左旋肉碱的色谱柱。
4. 淋洗液浓度的确定
依次选用6、5、4、3、2 mmol/l的甲基磺酸，测定 奶粉中左旋肉碱的色谱分析特征，确定合适的淋洗液浓 度。结果表明：随淋洗浓度从6 mmol/l降低到2 mmol/ l，背景电导从2231 us降低至777 us，噪声降低，理 论塔板数提高，各成分间的分离度增大，峰形改善，信 噪比从12增大至67.8，但保留时间也从6.91 min增大至 15.51 min。。综合考虑，我们选择3 mmol/l的甲基磺酸 作为分析用淋洗液。在优化的淋洗液浓度下，标准样品 及真实样品的左旋肉碱色谱图如图2所示。
5. 干扰因素
通过在前处理时加入钠柱，去除镁、钙、钾、铁、 铜、锰、锌等阳离子，避免干扰左旋肉碱。干扰电导响 应的乙腈，也已经在切换浓缩过程被纯水冲出浓缩柱， 因此不会干扰左旋肉碱的检测。
6. 检出限与线性范围
按实验方法在选定的色谱条件下，对左旋肉碱进行 线性和检出限测定。取标准工作液，以高纯水稀释成 0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1 mg/l，用离子色谱进行 检测，以峰面积y对质量浓度x（mg/l）进行作图，得回 归方程y=0.686x-0.006。线性范围17.5 mg/kg～175 mg/ kg，相关系数r>0.9995。取标准工作液，以高纯水稀释 成0.01、0.02、0.03、0.04 mg/l，按优化条件进行处理 后，以信噪比（s/n）≥3的低浓度作为奶粉中左旋肉 碱的检出限，测得左旋肉碱检出限为5 mg/kg。
7. 精密度与回收率
按实验方法，取市售奶粉样品进行不同浓度加标试 验，连续进样5次，测定左旋肉碱平均回收率和精密度， 结果列于表2，该方法的回收率在92.3%～105.2%之间， rsd在1.4%～4.3%之间。
实际样品分析:
按实验方法，惠氏膳儿加产品包装上左旋肉碱标示 含量为7.7 mg/100 g、本文所测结果与之接近。惠氏爱儿 乐和伊利奶粉包装上未标识添加有左旋肉碱，但本试验 依然检出，这可能与天然奶源中就含有一定量左旋肉碱 有关。
结论
采用阀切换-非抑制型离子色谱法来测定奶制品中的 左旋肉碱，具有简单、快速、干扰少、环保等特点。相 比常见的其它测试方法，避免了繁琐的前处理，无需衍 生化，节约时间，重复性好，检出限能满足要求。该方 法可用于奶粉中左旋肉碱的含量测定。
但本方法也有不足，即无法区分左旋肉碱和右旋肉 碱，这是作者仍需继续研究的课题之一。
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