荧光定量PCR(SYBR Green)总RNA提取方法步骤
总rna提取：
a组织样本：迅速将新鲜的组织切成合适的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用匀浆器匀浆。每30-50mg组织加1ml trizol。
b全血样品：加入3-5倍体积的红细胞裂解液到血样中，室温孵育10min，室温3500rpm离心6min。弃上清，原每2-3ml全血样品加1ml trizol。
c细胞样品：悬浮液中生长的细胞，通过离心收集细胞后，每1×105〜106细胞加入1ml trizol，移液器吹打混匀，直接裂解或-80℃储存一个月。贴壁生长的细胞，有两种处理方法。一种是移除培养基后，将1ml trizol直接加入直径3.5cm的培养皿中裂解细胞。或是先用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来并收集后，再加入1ml trizol进行裂解。（note：加入trizol前, pbs充分洗涤细胞去除残余培养基。）荧光定量pcr(sybr green)总rna提取方法步骤如下：
1、直接法
1）加入1ml trizol试剂，混匀，冰上孵育10min。
2）4℃，12000rpm离心10min，小心转移上清液到不含颗粒的新ep管中。
3）加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育5min。
4）4℃，12000rpm离心15min。混合液分三层，包括最下面的苯酚 - 氯仿有机相，中间相和上层水相。小心转移上层水相到新的ep管（大约60％体积的trizol），不要吸取中间相，可留下少量上层液体！（note：质量比数量更重要！）
5）加入等体积的异丙醇，轻轻地颠倒混匀约10次，室温放置10min。
6）4℃，12000rpm离心10min。弃上清，1ml 75％乙醇洗涤rna沉淀两次。
7）4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温下风干5-10min（不要太干，过度干燥会导致rna难溶解！）。将rna溶于15μl-50μldepc水中。
8）立即进行反转录反应，或先-80℃长期保存。
2、离心柱法(依据rna提取试剂盒说明书)
1）1、中步骤1）—4）。
2）加入1/2体积的无水乙醇，轻柔颠倒混匀。如有透明的纤维状物体，不影响下游步骤。
3）将所有裂解物/乙醇混合物转移至离心柱，置于2ml，静置2min。4℃，12000rpm离心3min，弃废液。
4）加入500ul洗涤液，静置2min。4℃，12000rpm离心30秒，弃废液。重复一次。
5）4℃，10,000rpm离心2min以除去残留的乙醇。
6）将离心柱置于新的rnase-free ep管中，加入30ul-50uldepc水，静置5min， 12000rpm离心2min收集。
7）立即进行反转录反应，或先-80℃长期保存。
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c细胞样品：悬浮液中生长的细胞，通过离心收集细胞后，每1×105〜106细胞加入1ml trizol，移液器吹打混匀，直接裂解或-80℃储存一个月。贴壁生长的细胞，有两种处理方法。一种是移除培养基后，将1ml trizol直接加入直径3.5cm的培养皿中裂解细胞。或是先用胰蛋白酶将贴壁细胞消化下来并收集后，再加入1ml trizol进行裂解。（note：加入trizol前, pbs充分洗涤细胞去除残余培养基。）荧光定量pcr(sybr green)总rna提取方法步骤如下：
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1）加入1ml trizol试剂，混匀，冰上孵育10min。
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3）加入200ul氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育5min。
4）4℃，12000rpm离心15min。混合液分三层，包括最下面的苯酚 - 氯仿有机相，中间相和上层水相。小心转移上层水相到新的ep管（大约60％体积的trizol），不要吸取中间相，可留下少量上层液体！（note：质量比数量更重要！）
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7）4℃，12000rpm离心5min，弃上清，室温下风干5-10min（不要太干，过度干燥会导致rna难溶解！）。将rna溶于15μl-50μldepc水中。
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2、离心柱法(依据rna提取试剂盒说明书)
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3）将所有裂解物/乙醇混合物转移至离心柱，置于2ml，静置2min。4℃，12000rpm离心3min，弃废液。
4）加入500ul洗涤液，静置2min。4℃，12000rpm离心30秒，弃废液。重复一次。
5）4℃，10,000rpm离心2min以除去残留的乙醇。
6）将离心柱置于新的rnase-free ep管中，加入30ul-50uldepc水，静置5min， 12000rpm离心2min收集。
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