干货│从原理到应用，带你全方面了解T4 gene 32 protein
t4噬菌体基因32编码蛋白(t4 gene 32 protein，gp32)是一种单链dna（ssdna）结合蛋白，为t4噬菌体dna复制和修复所必需。它被广泛地用于稳定和标记ssdna区域，以便用电子显微镜观察细胞内dna的结构、促进限制性内切酶的消化反应、提高rt-pcr中反转录的效率、增强t4 dna聚合酶的活性和提高pcr的产量等。
t4 gene 32 protein的结构t4 gene 32 protein由301个氨基酸组成，大小为34 kda，包含三个不同的结构域：核心结构域、n端结构域（ntd）和c端结构域（ctd）。核心结构域：包含ssdna的结合位点，并具区分单链、双链dna的能力；
c端结构域（ctd）：涉及异型蛋白相互作用，带负电荷，调节gp32与复制、修复和重组机制中其他成分的相互作用；
n端结构域（ntd）：负责同型蛋白相互作用，带正电荷，与邻近的gp32单体的核心结构域之间通过蛋白-蛋白接触，使gp32蛋白以头-尾方向结合ssdna。
图1. gp32结构域[1]
t4 gene 32 protein介导的dna重组修复a.dna损伤时，后随链合成冈崎片段，gp32与前导链结合当前导链聚合酶(红色)在dna损伤处（x）停滞时，前导链和后随链的合成会解耦联，后随链的合成机制可以合成与受损部位重叠的冈崎片段(绿线)，同时会在停滞的前导链聚合酶前面打开一个ssdna缺口，该缺口被gp32覆盖(橙色)；
b.模板子链3 '端解旋
gp32单体簇通过阻止dda解旋酶加载到后随链上来阻止其对复制叉移动的刺激，并促进模板子链3 '端的解旋；
c.模板转换恢复复制叉移动
uvsx重组酶和dda解旋酶催化模板转换来恢复停滞的复制叉；
d.跨损伤dna合成
进行后续无错误的跨损伤dna合成。
图2. gp32介导的重组修复过程[2]
t4 gene 32 protein应用01重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，rpa）该技术可以在37~42 ℃条件下实现待测靶标的快速检测，具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测，可广泛应用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
图3. 重组酶聚合酶扩增rpa技术扩增原理图[3]
rpa具体流程如下：
01重组酶引物复合体的形成重组酶t4 uvsx在atp的参与和定位因子（t4 uvsy）的帮助下与扩增引物结合形成重组酶引物复合体，并在双链dna中寻找同源序列；
02重组酶引物复合体定位至同源序列重组酶引物复合体一旦定位到同源序列，则会插入双链dna形成d-环结构，启动链置换反应，单链结合蛋白gp32会与解开的dna链结合防止进一步被置换；
03链置换扩增启动重组酶t4 uvsx从重组酶引物复合体中被水解，3'端引物暴露并与bsu dna聚合酶结合，dna开始复制延伸，最终两条母链分离，形成两条新的互补双链dna。该反应在37-42℃下进行，可在30 min内实现目标序列1012倍的扩增。
02核酸依赖性扩增检测技术（nucleic acid sequence-based amplification，nasba）该技术由一对引物介导，反应在42℃进行，可在2 h左右将模板rna扩增约109～1012倍，不需特殊的仪器，具有较高的特异性和灵敏度。广泛应用于病毒、细菌、霉菌、寄生虫和细胞因子等的检测，特别是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等rna病毒的检测当中。在动物疫病预防控制方面，nasba方法已成为诊断病毒的国家诊断标准方法之一（gb/t19440-2004 病毒nasba 检测方法）。
图4. nasba工作流程图[4]
在nasba中加入gp32，可以稳定逆转录形成的单链cdna，减少nasba中对热退火步骤的依赖，提高nasba程序的简单性。
03其他应用1）pcr扩增中，使用gp32可以显著地提高片段的扩增长度及产量[5]，并减轻血红素、腐殖酸等抑制物的对pcr扩增的抑制作用[6]。如图5所示，将浓度的抑制剂加入含有5 pg模板dna的反应混合物中，另外在不添加抑制剂的情况下，检测0.05、0.5和5 pg模板dna的扩增情况。结果显示在pcr体系种添加gp32可显著减轻抑制剂对pcr扩增的抑制。
图5.t4 gene 32 protein解除抑制剂对pcr的干扰[6]。a：不含gp32的标准pcr条件；b：含有150 ng/ml gp32的pcr条件
2）gp32通过阻止模板ssdna和rna二级结构的形成，分别增强t7 rna聚合酶和逆转录酶的活性，从而增加体外转录和逆转录的产量[7]。
翌圣t4 gene 32 protein翌圣的t4 gene 32 protein由zymeeditor酶改造平台重组表达而来，蛋白纯度高，核酸酶残留水平低，批次间稳定性优异，宿主dna残留水平极低，适用于rpa、nasba技术、pcr、ngs文库构建等应用。
客户测试案例展示
图5.客户测试翌圣重组酶聚合酶核心酶原料扩增结果图注：2、4为阳性实验组；1、3为阴性对照组
客户采用翌圣bsu dna polymerase (large fragment, 5 u/μl)、t4 uvsx recombinase (2 μg/μl)、t4 uvsy protein (2 μg/μl)、t4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶creatine kinase (2 μg/μl)进行rpa扩增反应，得到正确的目的条带，且条带清晰、明亮，结果表明，翌圣重组酶聚合酶扩增核心酶原料可实现高效rpa等温扩增。
rpa产品推荐产品名称
产品货号
产品作用
bsu dna polymerase (large fragment, 5 u/μl)
11078es
结合引物与原始靶核酸序列互补合成新的dna模板
t4 uvsx recombinase (2 μg/μl)
11079es
具有配对和链转移活性的重组酶
t4 uvsy protein (2 μg/μl)
11080es
重组酶辅助因子，刺激t4 uvsx的单链dna依赖性atp酶活性并降低活性所需的t4 uvsx临界浓度
t4 gene 32 protein (gp 32) t4噬菌体基因32编码蛋白
11081es
参与dna复制、修复、重组与解链后的单链dna结合，防止自杂交
creatine kinase (2 μg/μl) 肌酸激酶
14502es
刺激atp和肌酸分解为磷酸肌酸和adp，释放能量
exonuclease iii (100 u/μl)
14525es
具有3’→5’外切酶活性，切断荧光探针中淬灭基团，释放荧光
参考文献[1] cashen ba, morse m, rouzina i, karpel rl, williams mc. dynamic structure of t4 gene 32 protein filaments facilitates rapid noncooperative protein dissociation [published online ahead of print, 2023 jul 14]. nucleic acids res. 2023;gkad595.[2] jordan cs, morrical sw. regulation of the bacteriophage t4 dda helicase by gp32 single-stranded dna-binding protein. dna repair (amst). 2015;25:41-53.[3]王亚楠, 陈昌国. 重组酶聚合酶扩增技术研究进展[j]. 医学杂志, 2021, 46(5):8.[4] nai yh, doeven eh, guijt rm. an improved nucleic acid sequence-based amplification method mediated by t4 gene 32 protein. plos one. 2022;17(3):e0265391. published 2022 mar 24.[5] schwarz k, hansen-hagge t, bartram c. improved yields of long pcr products using gene 32 protein. nucleic acids res. 1990;18(4):1079.[6] kreader ca.relief of amplification inhibition in pcr with bovine serum albumin or t4 gene 32 protein. appl environ microbiol. 1996;62(3):1102-1106.[7] piché c, schernthaner jp. optimization of in vitro transcription and full-length cdna synthesis using the t4 bacteriophage gene 32 protein. j biomol tech. 2005;16(3):239-247.
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图1. gp32结构域[1]
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