治疗性抗体中糖基的全自动样品制备与快速分析
治疗性抗体中糖基的全自动样品制备与快速分析
在生物制药行业，治疗性抗体产品开发的各个阶段中，对于高通量的n-糖基化分析需求都在不断增大。尤其是在克隆筛选中，大量的样品需要在短时间内进行分析。对于n-糖基化分析，sciex公司近期开发了基于磁珠的样品处理方法，取代了当前常用的离心和真空离心的步骤。优化的磁珠方法可在4个小时内完成糖的释放、荧光标记和纯化过程，并具有良好的产率和高的重现性。本文展示了基于磁珠法进行自动化的糖基快速分析的所有步骤。优化了使用高通量自动化工作站和96孔板进行快速内切酶酶解、荧光标记和纯化的过程。同时也优化了毛细管电泳方法，结合激光诱导荧光检测器进行标记糖基的分析，以实现快速分离（＜3 min）。
溶液态的前处理方法需要较大的工作量，包括在样品分析之前糖基释放、纯化、荧光标记和预浓缩。此外，这种方法需要大量的离心和真空离心的步骤，使自动化工作站的使用变得困难并且昂贵。利用新型的基于磁珠处理样品的方法可以使大量的样品在96孔板中在小于4个小时的时间内完成前处理，并且避免了离心和真空离心的步骤。这个方法已经应用在biomek fxp 实验室自动化工作站上来制备和分析igg样品。荧光标记样品可在配有激光诱导荧光检测器的pa 800 plus毛细管电泳系统中进行超快速的分析，每个样品可在3 min之内完成分离。
实验步骤
自动化的样品制备过程在biomek fxp 实验室自动化工作站上进行，该工作站包括96孔板架、磁力支架、1000 µl和25 µl的移液枪头、1/4分隔试剂槽以及样品瓶和试剂瓶（图2）。试剂槽中含有乙腈（sigma aldrich, mo）和agencourt cleanseq磁珠（beckman coulter）。试剂瓶中包含pngase f酶（prozyme, hayward, ca）、溶于20 %醋酸中的apts（sciex, brea, ca）以及1 m氰基（in thf）（sciex, brea, ca）。为了减少溶剂挥发引起的体积损失，用移液盒盖子将试剂槽盖上。糖蛋白样品在biomek涡旋加热模块中进行孵育。为了充分离磁珠和悬浮液，将一块装有磁铁的空白板放在样品板下面，这样磁铁离样品管更近，可以快速吸引磁珠到小瓶底部，实现快速分配、悬浮。
图1. 配置激光诱导荧光检测器的pa 800 plus毛细管电泳系统（ce-lif）
方法
varadi等人近发表了磁珠辅助的手动进行样品前处理的步骤[1]。图3展示的是整个工作流程。在50 ℃条件下使用pngase f进行酶解1小时，随后在87.5%的乙腈中，糖基捕获在磁珠上[2]。加入氰基硼和apts，在37 ℃下对吸附在磁珠上的糖基进行原位的标记反应2小时。荧光标记的糖基在加入25 µl水之后可以从磁珠上洗脱下来，然后在pa800 plus-lif上进行分析（激发波长488 nm，发射波长520 nm）。在分离过程中使用n-cho毛细管（30/20 cm有效/总长度，50 µm内径），背景电解质为含有1 % peo（900,000）的25 mm醋酸锂溶液。分离电压为30 kv，毛细管温度为20 ℃。进样条件为3 psi压力进样6 s。自动化工作站使用4.0版本的biomek软件（图4）。使用32 karat软件进行ce-lif的数据采集和分析。
图2. biomek fxp实验室自动化工作站的实验装置
结果与分析
在这项工作中，我们将之前发表的磁珠辅助糖基释放、apts标记和样品纯化的方法应用于96孔板的biomek fx实验室自动化工作站中（图2）。结果表明，使用全自动的样品处理方法可以使样品处理缩短至<3.5小时，并且具有高的回收率和重现性。自动化工作站平台编程简单并且系统灵活实用，可以处理大量的样品。实验室自动化工作站提供了一个快速处理样品的功能，对天然生物样本中，减少了流动引起酶切失败及污染的风险。
由于自动化工作站的容量很大，ce-lif分析用的缓冲液也可在biomek fx上自动配置，比如自动化完成聚合物的溶解过程。
为了配合高通量自动化的样品制备过程，我们也对ce-lif的快速分析方法进行了优化，从自动化工作站的96孔板中连续进样（图5），在3分钟内lgg糖基即可得以基线分离。这种分离方法可以应用于克隆筛选中大量样品的快速分析。
pa800 plus毛细管电泳系统结合自动化工作站可对lgg的糖基进行快速、高通量的制备和分析。
图3.治疗性抗体n-糖基化分析中磁珠辅助的样品处理流程
图4.使用4.0版本biomek软件在自动化工作站中编辑运行程序
图5.磁珠辅助自动化工作站结合ce-lif对96个lgg的糖基进行快速分析
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方法
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