pcr扩增的工作原理
pcr实验是分子生物学中常见用的实验之一，在基因扩增、核酸检测、基因检测等方面广泛应用。pcr扩增的原理和步骤如下：
一、试剂准备：
pcr常用的试剂主要包括 dna 模板、引物、ddh2o、 dna 聚合酶以及特定的反应缓冲液、dntp、mgso4（可选）和 dmso （可选）。
二、pcr实验前的准备
在开始pcr实验之前，必须准备好dna模板（基因组dna 或逆转录制备的cdna）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)
1.dna聚合酶。有许多商业 dna 聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通taq 聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定 dna 片段进行 pcr，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的 taq 聚合酶。如果要对t-vector连接的片段进行pcr，要注意 ，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有 a-tailing，所以应该选择普通的taq聚合酶或在pcr 实验后添加 a-tailing。
2.引物的特异性影响 pcr 成功的概率，良好的引物设计对 pcr 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：
①引物的长度。pcr引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(tm)。tm 定义为在此温度下，dna 双链体的一半将解离成单链 dna。52-58c 范围内的引物 tm 是最佳的。
③gc 含量。最佳 gc 含量应为 40-60%。
④许多软件可用于引物设计，例如primer5和oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。
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在开始pcr实验之前，必须准备好dna模板（基因组dna 或逆转录制备的cdna）、特异性引物（自己设计或用软件设计），并选择合适的商业酶（选择符合您实验目的的酶)
1.dna聚合酶。有许多商业 dna 聚合酶，它们具有不同的特性。一般分为两类：高保真聚合酶和普通taq 聚合酶。如果您想对没有任何突变的特定 dna 片段进行 pcr，请选择高保真聚合酶。如果只是想检测特定序列的存在，就选择普通的 taq 聚合酶。如果要对t-vector连接的片段进行pcr，要注意 ，因为大多数高保真聚合酶的产物都没有 a-tailing，所以应该选择普通的taq聚合酶或在pcr 实验后添加 a-tailing。
2.引物的特异性影响 pcr 成功的概率，良好的引物设计对 pcr 扩增的成功至关重要。当您开始设计引物时，应仔细考虑以下几个原则：
①引物的长度。pcr引物一般在18-22bp左右。这对于引物特异性和在退火温度下的结合来说是足够长的。
②熔化温度(tm)。tm 定义为在此温度下，dna 双链体的一半将解离成单链 dna。52-58c 范围内的引物 tm 是最佳的。
③gc 含量。最佳 gc 含量应为 40-60%。
④许多软件可用于引物设计，例如primer5和oligo。这些软件推荐的引物通常可以满足我们的需求。
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