ULTRARIPA® Kit 应用数据
◆评价ultraripa® kit b buffer 单独提取脂筏蛋白的能力
（数据提供：东京大学 大学院药学系研究科 卫生化学教室）
用pbs清洗cos-1细胞后，用sds buffer、1％ triton x-100 buffer，ultraripa® kit a buffer以及ultraripa® kit b buffer溶解，离心（14,000 rpm, 5 min, 4°c）。分离可溶性组分和不溶性组分。不溶性组分用等量的sds-page sample buffer变性溶解。通过sds-page / western印迹评价脂筏标记物中flotilin 1的可溶解量。在普通1％triton x-100和ripa缓冲液中，大部分的flotilin 1保留在不溶性膜组分中，然而在ultraripa® kit b缓冲液中几乎全部溶解了。
各缓冲液的成分：
● sds buffer（2％sds, 1％ triton x-100, 50 mm hepes・na (ph 7.2), 150 mm nacl）
● ultraripa®kit a buffer (1％ np-40 alternative，0.1％ sds，50 mm tris-hcl (ph8.0)，150 mm
nacl，0.5％ sodium deoxycholate)
● ultraripa®kit b buffer （不公开成分）
● 1％ triton x-100 (1％ triton x-100, 50 mm hepes・na (ph 7.2), 150 mm nacl）
◆用ultraripa® kit观察ngf刺激依存的integrin的脂筏转换
（数据提供：国立精神·神经医疗研究中心 神经研究所 疾病研究第五部）
使用的样本：小鼠来源原代培养drg神经细胞（div13，～106 cells/35 mm dish）
目标蛋白：integrinβ1, flotillin 1
步骤：
1．在存在和不存在50ng/ml ngf的情况下培养神经细胞（各准备2个样品）
2．用pbs清洗cos-1细胞后，添加150 μl ultraripa® kit a-buffer，并在冰上孵育
3．离心分离可溶性组分①和不溶性组分
4．准备的2个a-buffer不溶性组分的样品，其中一个管添加150 μl 1× sds sample buffer使其*溶解②
5．添加150 μl b-buffer至另一管a-buffer不溶性组分中，悬浮沉淀物
6．离心并分离b-buffer可溶性组分③和不溶性组分
7．添加150 μl 1× sds-page sample buffer至b-buffer不溶性组分中，使其*溶解④
结果：
与ngf刺激中未看到flutillin的波动相比，观察到了integrinβ1通过ngf浓缩在ripa不溶性部分中。
◆使用ultraripa® kit分析神经突触相关蛋白的可溶性和复合物
（本数据是在funakoshi与学习院大学理学部 高岛明彦教授，住冈晓夫助教共同研究下取得）
■ 直接添加b-buffer验证溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的p2膜组分*
*p2模组分的回收步骤
从小鼠脑组织切除海马体以及大脑皮质，添加匀浆缓冲液（10 mm hepes (ph 7.4), 0.32 m sucrose, protease inhibitors）并用dounce型匀浆器破碎。
低速（×1,000 g）10分钟离心组织破碎液，去除沉淀的核组分（p1组分）。
上清（s1）组分用中速（×13,200 g）20分钟进一步离心，去除上清（s2）组分，回收沉淀的膜（p2）。
使用缓冲液条件：
sds：2％ sds, 50 mm tris-hcl (ph 8.0), 150 mm nacl
1％ triton：1％ tritonx-100, 50 mm tris-hcl (ph 8.0), 150 mm nacl ultraripa® kit
a-buffer(ripa)：1％ np-40, 0.5％ deoxycholate, 0.1％ sds, 50 mm tris-hcl (ph 8.0), 150 mm nacl
b-buffer：非公开
步骤：
1． 添加各缓冲液100 ml至p2组分中，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，沉淀不溶性组分，回收各可溶性组分
3． 添置100 μl 2% sds缓冲液至各不溶性组分并使其溶解。
结果：
在经过验证的所有神经突触相关蛋白中，ultraripa® kit b-buffer的溶解效率比1％triton x-100和ripa缓冲液（a-buffer）高。
■ 验证神经细胞膜来源ripa不溶性组分的b-buffer溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的p2膜组分
步骤：
1． 添加200 μl a-buffer（ripa）至p2膜组分，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，除去可溶性组分，单独分离不溶性组分。
3． 添加200 ml 2% sds，a-buffer或b-buffer至a-buffer不溶性组分，在冰上进行超声处理
4． 离心（×100,000 g）各溶液，并分离可溶性组分和不溶性组分
5． 为了检测b-buffer不溶性组分中残留的蛋白，添加2% sds至b-buffer组分中使其*溶解
结果：
发现b-buffer能够溶解神经细胞膜的ripa不溶性组分中包含的大多数蛋白。
此外，还可以高效提取nmda型*受体亚基的glun1和glun2b。
另一方面，尽管psd 95的可溶性有所提高，但发现它仍残留在b-buffer的不溶性组分中。
■ 使用ultraripa® kit分析神经突触蛋白复合物
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的p2膜组分
目标：nmda型*受体nmdar（glun1/glun2b）
ampa型*受体 ampar（glua1/glua2）
步骤：
1． 添加ultraripa®kit b-buffer至p2膜组分，在冰上进行超声处理；
2． 高速离心（×100,000 g）破碎液，获取可溶性组分；
3． 添加1 μg对照igg或抗glun2b抗体或glua2/3抗体至100 μl可溶性组分，并在4°c下反应1小时后，添
加20μl bed vol protein a磁珠并反应1小时；
4． 用pbst（0.05% tween20 in pbs）清洗磁珠3次；
5． 添加1×sds-page样本缓冲液，在100°c加热条件下洗脱。
结果：
使用ultraripa® kit b-buffer，nmdar，ampar都能通过免疫沉淀特异性的检测出复合物。
＊syn (synaptophysin)
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各缓冲液的成分：
● sds buffer（2％sds, 1％ triton x-100, 50 mm hepes・na (ph 7.2), 150 mm nacl）
● ultraripa®kit a buffer (1％ np-40 alternative，0.1％ sds，50 mm tris-hcl (ph8.0)，150 mm
nacl，0.5％ sodium deoxycholate)
● ultraripa®kit b buffer （不公开成分）
● 1％ triton x-100 (1％ triton x-100, 50 mm hepes・na (ph 7.2), 150 mm nacl）
◆用ultraripa® kit观察ngf刺激依存的integrin的脂筏转换
（数据提供：国立精神·神经医疗研究中心 神经研究所 疾病研究第五部）
使用的样本：小鼠来源原代培养drg神经细胞（div13，～106 cells/35 mm dish）
目标蛋白：integrinβ1, flotillin 1
步骤：
1．在存在和不存在50ng/ml ngf的情况下培养神经细胞（各准备2个样品）
2．用pbs清洗cos-1细胞后，添加150 μl ultraripa® kit a-buffer，并在冰上孵育
3．离心分离可溶性组分①和不溶性组分
4．准备的2个a-buffer不溶性组分的样品，其中一个管添加150 μl 1× sds sample buffer使其*溶解②
5．添加150 μl b-buffer至另一管a-buffer不溶性组分中，悬浮沉淀物
6．离心并分离b-buffer可溶性组分③和不溶性组分
7．添加150 μl 1× sds-page sample buffer至b-buffer不溶性组分中，使其*溶解④
结果：
与ngf刺激中未看到flutillin的波动相比，观察到了integrinβ1通过ngf浓缩在ripa不溶性部分中。
◆使用ultraripa® kit分析神经突触相关蛋白的可溶性和复合物
（本数据是在funakoshi与学习院大学理学部 高岛明彦教授，住冈晓夫助教共同研究下取得）
■ 直接添加b-buffer验证溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的p2膜组分*
*p2模组分的回收步骤
从小鼠脑组织切除海马体以及大脑皮质，添加匀浆缓冲液（10 mm hepes (ph 7.4), 0.32 m sucrose, protease inhibitors）并用dounce型匀浆器破碎。
低速（×1,000 g）10分钟离心组织破碎液，去除沉淀的核组分（p1组分）。
上清（s1）组分用中速（×13,200 g）20分钟进一步离心，去除上清（s2）组分，回收沉淀的膜（p2）。
使用缓冲液条件：
sds：2％ sds, 50 mm tris-hcl (ph 8.0), 150 mm nacl
1％ triton：1％ tritonx-100, 50 mm tris-hcl (ph 8.0), 150 mm nacl ultraripa® kit
a-buffer(ripa)：1％ np-40, 0.5％ deoxycholate, 0.1％ sds, 50 mm tris-hcl (ph 8.0), 150 mm nacl
b-buffer：非公开
步骤：
1． 添加各缓冲液100 ml至p2组分中，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，沉淀不溶性组分，回收各可溶性组分
3． 添置100 μl 2% sds缓冲液至各不溶性组分并使其溶解。
结果：
在经过验证的所有神经突触相关蛋白中，ultraripa® kit b-buffer的溶解效率比1％triton x-100和ripa缓冲液（a-buffer）高。
■ 验证神经细胞膜来源ripa不溶性组分的b-buffer溶解效率
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的p2膜组分
步骤：
1． 添加200 μl a-buffer（ripa）至p2膜组分，在冰上进行超声处理
2． 高速（×100,000 g）离心破碎液，除去可溶性组分，单独分离不溶性组分。
3． 添加200 ml 2% sds，a-buffer或b-buffer至a-buffer不溶性组分，在冰上进行超声处理
4． 离心（×100,000 g）各溶液，并分离可溶性组分和不溶性组分
5． 为了检测b-buffer不溶性组分中残留的蛋白，添加2% sds至b-buffer组分中使其*溶解
结果：
发现b-buffer能够溶解神经细胞膜的ripa不溶性组分中包含的大多数蛋白。
此外，还可以高效提取nmda型*受体亚基的glun1和glun2b。
另一方面，尽管psd 95的可溶性有所提高，但发现它仍残留在b-buffer的不溶性组分中。
■ 使用ultraripa® kit分析神经突触蛋白复合物
使用的样本：小鼠脑组织（海马体+大脑皮质）来源的p2膜组分
目标：nmda型*受体nmdar（glun1/glun2b）
ampa型*受体 ampar（glua1/glua2）
步骤：
1． 添加ultraripa®kit b-buffer至p2膜组分，在冰上进行超声处理；
2． 高速离心（×100,000 g）破碎液，获取可溶性组分；
3． 添加1 μg对照igg或抗glun2b抗体或glua2/3抗体至100 μl可溶性组分，并在4°c下反应1小时后，添
加20μl bed vol protein a磁珠并反应1小时；
4． 用pbst（0.05% tween20 in pbs）清洗磁珠3次；
5． 添加1×sds-page样本缓冲液，在100°c加热条件下洗脱。
结果：
使用ultraripa® kit b-buffer，nmdar，ampar都能通过免疫沉淀特异性的检测出复合物。
＊syn (synaptophysin)
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附件一:向心轴承容许差及容许值
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