高速离心机的分离方法特点和衡量离心机分离性能的指标
我们前面已经分享了很多关于离心机的知识，本次主要来说一些比较基础性的东西，下面就来介绍下高速离心机的分离方法特点和衡量离心机分离性能的指标。
制备型超高速离心机的几种分离方法：
a．差速离心：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的一些组份。
差速离心是一种zui常用的方法。在这种方法中，离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在一定速度下一定时间的离心后，就可得到两个部份：沉淀和上清液。
通常在*次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到的上清液以更高速度离心，把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心，直到达到所需要的分离纯度为止。
差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。
b．密度梯度离心法：可以同时使样品中几个或全部组份分离，具有很好的分辨率。
（1）速率区带法（ratezonal）：
根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度（s）。大致步骤如下：
在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加（正梯度）。
将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。
由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。
注意：样品粒子的密度必须大于梯度液注中任一点的密度。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。
（2）等密度离心法（isopycnic）：
根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。
密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。
注意：平衡后粒子的分离*由其密度决定，与时间无关，此时再改变离心转速，只能改变区带的相对位置。
密度梯度分析法
（1）梯度介质性质与选择：
a、应具备的性质：
梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求，一个理想的密度材料标准它应是：
所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。
具有某些性质，如折射率，据此可测定它的浓度。
所形成的溶液粘度低。
不损伤所分离的样品。离心分离后容易除去。
不妨碍分离积分的分析。
b、常用介质种类：
表一、常用梯度材料在20℃密度
b．梯度介质应用范围：
表二、等密度梯度介质的应用
表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度
（2）、梯度溶液的准备：
计算,稀释
（3）梯度形状
梯度形状分：线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。
梯度形状对于分离是否成功非常重要：
zui常用的是线型梯度，适用于分离蛋白质、酶、激素、核糖体亚基和一些植物病毒；等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品；不连续或阶梯型梯度zui适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力，适用于分离核糖体亚基、多核糖体及植物病毒。
b．梯度柱制备：
梯度液柱可以用手工或梯度仪制备
半注法：
为缩减离心时间，或分离样品较少可用半注法：下半管铺置梯度介质，中间加样品，上面铺buffer或液体石腊油。
（4）加样方法与加样量：
将样品加到梯度液柱上，针尖和离心管成45-60°角度，慢慢地将样品沿管壁流到液面上去，对于dna一类易断的脆弱样品，应该用孔径较大的移液管代替针头，以避免剪切力对样品的切割作用。样品浓度是梯度柱zui小密度的1/10（w/w）。
（5）转子的选择与效应：
（6）分离区带的回收及检测
离心后所形成的区带样品的回收方法基本有四种：
a.穿刺法
穿刺离心管底部，使梯度溶液滴出，将一具有合适阀门的盖帽放在离心管顶，可控制滴出速度。
b.虹吸法：
将一毛细管轻轻插入管底，尽量防止梯度抖动，用微量泵逐渐滴取，以一定量滴数或体积部分收取。
c.加压法：
通过一针管将高密度的液体泵入到梯度离心管的底部，部分收集换出的溶液。
d.切割法：
采用的切割刀切割所需区带。区带检测：
所谓区带检测，实际上是对水平转子或角转子和垂直转子离心管中的分离物质所做的监测，通常只是测量在260或280mm时长的吸收值，以决定梯度中的核酸或蛋白的整个分布，这个操作通常称之为在线（online）监测。
衡量离心分离机分离性能的重要指标是分离因数。它表示被分离物料在转鼓内所受的离心力与其重力的比值，分离因数越大，通常分离也越迅速，分离效果越好。工业用离心分离机的分离因数一般为100～20000，超速管式分离机的分离因数可高达62000，分析用超速分离机的分离因数zui高达610000。决定离心分离机处理能力的另一因素是转鼓的工作面积，工作面积大处理能力也大。
过滤离心机和沉降离心机，主要依靠加大转鼓直径来扩大转鼓圆周上的工作面；分离机除转鼓圆周壁外，还有附加工作面，如碟式分离机的碟片和室式分离机的内筒，显著增大了沉降工作面。
此外，悬浮液中固体颗粒越细则分离越困难，滤液或分离液中带走的细颗粒会增加，在这种情况下，离心分离机需要有较高的分离因数才能有效地分离；悬浮液中液体粘度大时，分离速度减慢；悬浮液或乳浊液各组分的密度差大，对离心沉降有利，而悬浮液离心过滤则不要求各组分有密度差。
选择离心分离机须根据悬浮液（或乳浊液）中固体颗粒的大小和浓度、固体与液体（或两种液体）的密度差、液体粘度、滤渣（或沉渣）的特性，以及分离的要求等进行综合分析，满足对滤渣（沉渣）含湿量和滤液（分离液）澄清度的要求，初步选择采用哪一类离心分离机。然后按处理量和对操作的自动化要求，确定离心机的类型和规格，zui后经实际试验验证。
通常，对于含有粒度大于0.01毫米颗粒的悬浮液，可选用过滤离心机；对于悬浮液中颗粒细小或可压缩变形的，则宜选用沉降离心机；对于悬浮液含固体量低、颗粒微小和对液体澄清度要求高时，应选用分离机。
离心分离机未来的发展趋势将是强化分离性能、发展大型的离心分离机、改进卸渣机构、增加和组合转鼓离心机、加强分离理论研究和研究离心分离过程*化控制技术等。
强化分离性能包括提高转鼓转速；在离心分离过程中增加新的推动力；加快推渣速度；增大转鼓长度使离心沉降分离的时间延长等。发展大型的离心分离机，主要是加大转鼓直径和采用双面转鼓提高处理能力使处理单位体积物料的设备投资、能耗和维修费降低。理论研究方面，主要研究转鼓内流体流动状况和滤渣形成机理，研究zui小分离度和处理能力的计算方法。
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a．差速离心：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的一些组份。
差速离心是一种zui常用的方法。在这种方法中，离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在一定速度下一定时间的离心后，就可得到两个部份：沉淀和上清液。
通常在*次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到的上清液以更高速度离心，把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心，直到达到所需要的分离纯度为止。
差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。
b．密度梯度离心法：可以同时使样品中几个或全部组份分离，具有很好的分辨率。
（1）速率区带法（ratezonal）：
根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度（s）。大致步骤如下：
在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加（正梯度）。
将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。
由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。
注意：样品粒子的密度必须大于梯度液注中任一点的密度。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。
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根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。
密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。
注意：平衡后粒子的分离*由其密度决定，与时间无关，此时再改变离心转速，只能改变区带的相对位置。
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（1）梯度介质性质与选择：
a、应具备的性质：
梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求，一个理想的密度材料标准它应是：
所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。
具有某些性质，如折射率，据此可测定它的浓度。
所形成的溶液粘度低。
不损伤所分离的样品。离心分离后容易除去。
不妨碍分离积分的分析。
b、常用介质种类：
表一、常用梯度材料在20℃密度
b．梯度介质应用范围：
表二、等密度梯度介质的应用
表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度
（2）、梯度溶液的准备：
计算,稀释
（3）梯度形状
梯度形状分：线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。
梯度形状对于分离是否成功非常重要：
zui常用的是线型梯度，适用于分离蛋白质、酶、激素、核糖体亚基和一些植物病毒；等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品；不连续或阶梯型梯度zui适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力，适用于分离核糖体亚基、多核糖体及植物病毒。
b．梯度柱制备：
梯度液柱可以用手工或梯度仪制备
半注法：
为缩减离心时间，或分离样品较少可用半注法：下半管铺置梯度介质，中间加样品，上面铺buffer或液体石腊油。
（4）加样方法与加样量：
将样品加到梯度液柱上，针尖和离心管成45-60°角度，慢慢地将样品沿管壁流到液面上去，对于dna一类易断的脆弱样品，应该用孔径较大的移液管代替针头，以避免剪切力对样品的切割作用。样品浓度是梯度柱zui小密度的1/10（w/w）。
（5）转子的选择与效应：
（6）分离区带的回收及检测
离心后所形成的区带样品的回收方法基本有四种：
a.穿刺法
穿刺离心管底部，使梯度溶液滴出，将一具有合适阀门的盖帽放在离心管顶，可控制滴出速度。
b.虹吸法：
将一毛细管轻轻插入管底，尽量防止梯度抖动，用微量泵逐渐滴取，以一定量滴数或体积部分收取。
c.加压法：
通过一针管将高密度的液体泵入到梯度离心管的底部，部分收集换出的溶液。
d.切割法：
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所谓区带检测，实际上是对水平转子或角转子和垂直转子离心管中的分离物质所做的监测，通常只是测量在260或280mm时长的吸收值，以决定梯度中的核酸或蛋白的整个分布，这个操作通常称之为在线（online）监测。
衡量离心分离机分离性能的重要指标是分离因数。它表示被分离物料在转鼓内所受的离心力与其重力的比值，分离因数越大，通常分离也越迅速，分离效果越好。工业用离心分离机的分离因数一般为100～20000，超速管式分离机的分离因数可高达62000，分析用超速分离机的分离因数zui高达610000。决定离心分离机处理能力的另一因素是转鼓的工作面积，工作面积大处理能力也大。
过滤离心机和沉降离心机，主要依靠加大转鼓直径来扩大转鼓圆周上的工作面；分离机除转鼓圆周壁外，还有附加工作面，如碟式分离机的碟片和室式分离机的内筒，显著增大了沉降工作面。
此外，悬浮液中固体颗粒越细则分离越困难，滤液或分离液中带走的细颗粒会增加，在这种情况下，离心分离机需要有较高的分离因数才能有效地分离；悬浮液中液体粘度大时，分离速度减慢；悬浮液或乳浊液各组分的密度差大，对离心沉降有利，而悬浮液离心过滤则不要求各组分有密度差。
选择离心分离机须根据悬浮液（或乳浊液）中固体颗粒的大小和浓度、固体与液体（或两种液体）的密度差、液体粘度、滤渣（或沉渣）的特性，以及分离的要求等进行综合分析，满足对滤渣（沉渣）含湿量和滤液（分离液）澄清度的要求，初步选择采用哪一类离心分离机。然后按处理量和对操作的自动化要求，确定离心机的类型和规格，zui后经实际试验验证。
通常，对于含有粒度大于0.01毫米颗粒的悬浮液，可选用过滤离心机；对于悬浮液中颗粒细小或可压缩变形的，则宜选用沉降离心机；对于悬浮液含固体量低、颗粒微小和对液体澄清度要求高时，应选用分离机。
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强化分离性能包括提高转鼓转速；在离心分离过程中增加新的推动力；加快推渣速度；增大转鼓长度使离心沉降分离的时间延长等。发展大型的离心分离机，主要是加大转鼓直径和采用双面转鼓提高处理能力使处理单位体积物料的设备投资、能耗和维修费降低。理论研究方面，主要研究转鼓内流体流动状况和滤渣形成机理，研究zui小分离度和处理能力的计算方法。
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