引物退火温度会影响到荧光-PCR法？
定量荧光-pcr法是在pcr定性技术基础上发展起来的定量技术。实时荧光定量pcr技术（fq-pcr）是一种在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，实现了pcr从定性到定量的飞跃。简单的说，就是在pcr体系中加入荧光，以便对反应体系和反应进程进行监测、记录、分析。而荧光pcr仪是在普通pcr的基础上加上个荧光探头和相应的数据处理软件。
说道引物的一个重要参数是熔解温度（tm），这是当50％的引物和互补序列表现为双链dna分子时的温度。tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55-70℃。退火温度一般设定比引物的tm低5℃。
设定tm有几种公式。确定引物tm最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法。从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有软件会自动计算引物的tm值，在设置退火温度时可如下进行：
以低于估算的tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得理想结果，两个引物应具有近似的tm值。引物对的tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物tm不同，将退火温度设定为比低的tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
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