赛智科技关于工业明胶的检测方案
zui近，一则关于“果冻，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在网上疯传，因破皮鞋可以提炼出明胶。经调查发现，不仅老酸奶，多种果粒酸奶、谷物酸奶，甚至普通酸牛奶中，几乎都含有中含有明胶、琼脂、卡拉胶、果胶等食品增稠剂。明胶的品质主要取决于原料。通常来说，合格的明胶是从动物鲜皮、骨料内提胶，经6道提胶工序后，对提取的明胶进行蒸发、干燥，zui后根据多项控制指标进行混合形成成品。但为了降低成本，获得更多利润，国内很多厂家用皮革厂经过鞣铬加工后的蓝矾皮的皮革屑，边角料、烂皮革等作为生产原料。皮革制成的明胶透明，无味，消费者根本无法将正规的食用明胶和皮革制成的明胶区分开来。
皮革水解蛋白是皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对l-羟*含量的测定。l-羟*是胶原蛋白（皮革水解蛋白）*的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为可能含有皮革水解蛋白，即可判断该乳制品中有可能含有由废弃皮革而来的成分。
赛智科技应用质检部采用l-羟*衍生方法，利用公司自己的，对l-羟*进行了分析检测试验，并通过公司的进行了详细分析，得出的检测结果准确，可靠，供广大客户参考使用。
以下是l-羟*的测定的详细检测方法：
l-羟*的液相色谱仪（hplc）测定
1 仪器与试剂
1.1 仪器、器皿
1.1.1 lc-10tvp液相色谱仪
1.1.2 vertex 色谱柱 250mm×4.6mm×5μm
1.1.3 11 ml水解瓶
1.1.4 1.5 ml塑料离心管
1.1.5 20 ml玻璃具塞刻度试管
1.1.6 5 ml玻璃具塞刻度试管
1.1.7 0.22 μm针头式过滤器
1.1.8 2 ml样品瓶
1.2 试剂
1.2.1 甲醇（色谱纯）
1.2.2 乙腈（色谱纯）
1.2.3 正己烷（色谱纯）
1.2.3 三乙胺（色谱纯）
1.2.4 冰醋酸（色谱纯）
1.2.5 *（无水色谱纯）
1.2.6 *（无水色谱纯）
1.2.7 l-羟*标准品
1.2.8 蛋白水解试剂：称取0.1 g*置于100 ml容量瓶，加入50 ml浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/l），然后加水定容至100 ml。
1.2.9 0.1 mol/l hcl水溶液：量取8.3 ml浓盐酸，然后用纯水定容至1000 ml。
1.2.10 衍生剂pitc溶液：将250 μl异硫氰酸苯酯（pitc）用乙腈定容至10 ml。
1.2.11 三乙胺溶液：将1.4 ml三乙胺用乙腈定容至10 ml。
1.2.12 衍生剂dnfb溶液：0.5 ml 2,4-二硝基氟苯（dnfb）溶于50 ml乙腈。
1.2.13 na2b4o7缓冲溶液：称取1.91 g na2b4o7•10h2o，用50 ml纯水溶解。
1.2.14 氨基酸储备液：称取一定量l-羟*，用0.1 mol/l hcl水溶液溶解，得到浓度为 0.05 mol/l的储备溶液。
1.2.15 氨基酸使用液：将储备液用0.1 mol/l hcl水溶液稀释，得到浓度为0.0003 mol/l的l-羟*溶液。
1.2.16 磷酸盐缓冲溶液：0.02 mol/l na2hpo4 和nah2po4水溶液。
2 实验方法
2.1 样品水解
（1） 称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（1.1.3），加入蛋白水解试剂（1.2.8），旋紧盖子，振荡混匀，110 °c下反应24 h。
（2） 反应完毕，将反应液全部转移至100 ml蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。
（3） 用12 ml0.1 mol/l hcl水溶液（1.2.9）分三次溶解残渣，并转移到20 ml玻璃具塞刻度试管（1.1.5），再用纯水定容至20 ml，待衍生。
2.2 样品衍生
2.2.1 异硫氰酸苯酯（pitc）衍生方法
（1）样品水解溶液衍生
量取200 μl样品水解溶液，置于1.5 ml塑料离心管中，加入100 μl三乙胺溶液（1.2.11）和100 μl衍生剂pitc溶液（1.2.10），混匀，室温反应1h，加入400μl正己烷（1.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μl下层溶液与800 μl水混合，经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
（2） 标准溶液衍生化
量取200 μl l-羟*使用液*（1.2.15），置于1.5 ml塑料离心管中，加入100 μl三乙胺溶液（1.2.11）和100 μl衍生剂pitc溶液（1.2.10），混匀，室温反应1h，加入正己烷400 μl（1.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μl下层溶液与800 μl水混合，经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
*根据实际情况，氨基酸使用液浓度可进行调整，本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。
2.2.2 2,4-二硝基氟苯（dnfb）衍生方法
（1） 样品溶液衍生
取0.5 ml样品水解溶液置于5 ml玻璃具塞刻度试管（1.1.6）中，加入0.5 ml na2b4o7缓冲溶液（1.2.13）和0.5 ml衍生剂dnfb溶液（1.2.12），具塞摇匀，于60 °c下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（1.2.16）定容至5 ml，混匀后经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
（2） 标准溶液衍生
取0.5 ml l-羟*使用液（1.2.15）置于5 ml玻璃具塞刻度试管（1.1.6）中，加入0.5 ml na2b4o7缓冲溶液（1.2.13）和0.5 ml衍生剂dnfb溶液（1.2.12），具塞摇匀，于60 °c下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（1.2.16）定容至5 ml，混匀后经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
2.3 色谱条件
2.3.1 异硫氰酸苯酯（pitc）衍生色谱条件
色谱柱： vertex 色谱柱250mm×4.6mm×5μm
流动相a： 0.05mol/l乙酸钠水溶液（冰乙酸调节ph值为6.50±0.05）
流动相b: 甲醇：乙腈：水=20:60:20（v:v:v）
流速： 1.0 ml/min
检测波长： uv 254 nm
柱温： 45℃
进样体积： 10μl
梯度程序：
时间/min
0
39
40
45
46
60
流动相a/%
95
52
0
0
95
95
流动相b/%
5
48
100
100
5
5
2.3.2 2,4二硝基氟苯（dnfb）衍生色谱条件
色谱柱： vertex 色谱柱
流动相a： 0.02mol/l na2hpo4+ 0.02mol/l nah2po4水溶液
流动相b: 甲醇：乙腈=10:90（v:v）
流速： 1.0 ml/min
检测波长： uv 360 nm
柱温： 35℃
进样体积： 10μl
梯度程序：
时间/min
0
35
42
50
60
流动相a/%
86
60
30
86
86
流动相b/%
14
40
70
14
14
3 色谱图
赛智科技（杭州）有限公司
市场部 <宣>
2012.04.19
关于赛智科技：
赛智科技是目前大的液相色谱仪生产厂家之一，主要产品有：、、浙大n2010色谱工作站、n2000色谱工作站sp1版、、sti501液相色谱仪、vertex5000液相色谱仪、solar系列光纤光谱仪等。
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水下管道堵漏（费用相对便宜）
皮革水解蛋白是皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对l-羟*含量的测定。l-羟*是胶原蛋白（皮革水解蛋白）*的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为可能含有皮革水解蛋白，即可判断该乳制品中有可能含有由废弃皮革而来的成分。
赛智科技应用质检部采用l-羟*衍生方法，利用公司自己的，对l-羟*进行了分析检测试验，并通过公司的进行了详细分析，得出的检测结果准确，可靠，供广大客户参考使用。
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1 仪器与试剂
1.1 仪器、器皿
1.1.1 lc-10tvp液相色谱仪
1.1.2 vertex 色谱柱 250mm×4.6mm×5μm
1.1.3 11 ml水解瓶
1.1.4 1.5 ml塑料离心管
1.1.5 20 ml玻璃具塞刻度试管
1.1.6 5 ml玻璃具塞刻度试管
1.1.7 0.22 μm针头式过滤器
1.1.8 2 ml样品瓶
1.2 试剂
1.2.1 甲醇（色谱纯）
1.2.2 乙腈（色谱纯）
1.2.3 正己烷（色谱纯）
1.2.3 三乙胺（色谱纯）
1.2.4 冰醋酸（色谱纯）
1.2.5 *（无水色谱纯）
1.2.6 *（无水色谱纯）
1.2.7 l-羟*标准品
1.2.8 蛋白水解试剂：称取0.1 g*置于100 ml容量瓶，加入50 ml浓盐酸（36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/l），然后加水定容至100 ml。
1.2.9 0.1 mol/l hcl水溶液：量取8.3 ml浓盐酸，然后用纯水定容至1000 ml。
1.2.10 衍生剂pitc溶液：将250 μl异硫氰酸苯酯（pitc）用乙腈定容至10 ml。
1.2.11 三乙胺溶液：将1.4 ml三乙胺用乙腈定容至10 ml。
1.2.12 衍生剂dnfb溶液：0.5 ml 2,4-二硝基氟苯（dnfb）溶于50 ml乙腈。
1.2.13 na2b4o7缓冲溶液：称取1.91 g na2b4o7•10h2o，用50 ml纯水溶解。
1.2.14 氨基酸储备液：称取一定量l-羟*，用0.1 mol/l hcl水溶液溶解，得到浓度为 0.05 mol/l的储备溶液。
1.2.15 氨基酸使用液：将储备液用0.1 mol/l hcl水溶液稀释，得到浓度为0.0003 mol/l的l-羟*溶液。
1.2.16 磷酸盐缓冲溶液：0.02 mol/l na2hpo4 和nah2po4水溶液。
2 实验方法
2.1 样品水解
（1） 称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中（1.1.3），加入蛋白水解试剂（1.2.8），旋紧盖子，振荡混匀，110 °c下反应24 h。
（2） 反应完毕，将反应液全部转移至100 ml蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。
（3） 用12 ml0.1 mol/l hcl水溶液（1.2.9）分三次溶解残渣，并转移到20 ml玻璃具塞刻度试管（1.1.5），再用纯水定容至20 ml，待衍生。
2.2 样品衍生
2.2.1 异硫氰酸苯酯（pitc）衍生方法
（1）样品水解溶液衍生
量取200 μl样品水解溶液，置于1.5 ml塑料离心管中，加入100 μl三乙胺溶液（1.2.11）和100 μl衍生剂pitc溶液（1.2.10），混匀，室温反应1h，加入400μl正己烷（1.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μl下层溶液与800 μl水混合，经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
（2） 标准溶液衍生化
量取200 μl l-羟*使用液*（1.2.15），置于1.5 ml塑料离心管中，加入100 μl三乙胺溶液（1.2.11）和100 μl衍生剂pitc溶液（1.2.10），混匀，室温反应1h，加入正己烷400 μl（1.2.3），旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μl下层溶液与800 μl水混合，经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
*根据实际情况，氨基酸使用液浓度可进行调整，本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。
2.2.2 2,4-二硝基氟苯（dnfb）衍生方法
（1） 样品溶液衍生
取0.5 ml样品水解溶液置于5 ml玻璃具塞刻度试管（1.1.6）中，加入0.5 ml na2b4o7缓冲溶液（1.2.13）和0.5 ml衍生剂dnfb溶液（1.2.12），具塞摇匀，于60 °c下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（1.2.16）定容至5 ml，混匀后经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
（2） 标准溶液衍生
取0.5 ml l-羟*使用液（1.2.15）置于5 ml玻璃具塞刻度试管（1.1.6）中，加入0.5 ml na2b4o7缓冲溶液（1.2.13）和0.5 ml衍生剂dnfb溶液（1.2.12），具塞摇匀，于60 °c下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液（1.2.16）定容至5 ml，混匀后经0.22 μm针式过滤器（1.1.7）过滤，待分析。
2.3 色谱条件
2.3.1 异硫氰酸苯酯（pitc）衍生色谱条件
色谱柱： vertex 色谱柱250mm×4.6mm×5μm
流动相a： 0.05mol/l乙酸钠水溶液（冰乙酸调节ph值为6.50±0.05）
流动相b: 甲醇：乙腈：水=20:60:20（v:v:v）
流速： 1.0 ml/min
检测波长： uv 254 nm
柱温： 45℃
进样体积： 10μl
梯度程序：
时间/min
0
39
40
45
46
60
流动相a/%
95
52
0
0
95
95
流动相b/%
5
48
100
100
5
5
2.3.2 2,4二硝基氟苯（dnfb）衍生色谱条件
色谱柱： vertex 色谱柱
流动相a： 0.02mol/l na2hpo4+ 0.02mol/l nah2po4水溶液
流动相b: 甲醇：乙腈=10:90（v:v）
流速： 1.0 ml/min
检测波长： uv 360 nm
柱温： 35℃
进样体积： 10μl
梯度程序：
时间/min
0
35
42
50
60
流动相a/%
86
60
30
86
86
流动相b/%
14
40
70
14
14
3 色谱图
赛智科技（杭州）有限公司
市场部 <宣>
2012.04.19
关于赛智科技：
赛智科技是目前大的液相色谱仪生产厂家之一，主要产品有：、、浙大n2010色谱工作站、n2000色谱工作站sp1版、、sti501液相色谱仪、vertex5000液相色谱仪、solar系列光纤光谱仪等。
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