UDI? UMI?文库构建试剂盒如何选择
相信有些小伙伴已经隐隐约约有听说过udi和umi这两个英文缩写，但是一直没搞清楚它们全名是啥？它们能干啥？
在正文开始前，我们先来“揭秘”udi和umi的全称：
udi的全称为unique dual index，译为双端不重复标签技术。
umi的全称为unique molecular identifier，译为分子条形码或者分子标签技术。
别急，要弄清这两个概念，还得从二代测序的那些事情说起：
我们都知道二代测序技术是近十年来曝光率非常高、非常受关注的基因组分析技术。以illumina为代表的测序仪厂商不断推出更新型号的测序仪，不断刷新测序通量，但不变的仍是多样本混合后测序的策略。
要实现对多个样本同时测序，必须在各样本pcr扩增阶段，往核酸片段上添加一段分子序列作为样本标签，这种标签叫做index。
这样，每个样本就带上属于它的“专属号码牌”，在多样本混合测序后，生信工程师能通过“翻牌”，确定这个“号码”所代表的就是“寻寻觅觅”的那个“它”。
index一般由8位碱基所组成，常有单端与双端两种添加模式，为了增加同时上样的通量，大家一般在面临大量样本同时测序时，会选择双端index↓
目前常用的双端index策略是通过少数几种index序列排列组合，去实现更多样本的标签区分（如96种），但这种方式一直存在交叉污染的可能。
同时，为了进一步提升通量与扩增效率，降低测序成本，illumina为novaseq等高通量型测序仪引入了图案化流动槽（patterned flow cell technology，pfct）和排他性扩增（exclusion amplification，examp）成簇技术。这两个看似美好的技术却无意间放大了一种叫做标签跳跃（index hopping）的样本标签错配的现象，导致科研人员无法正确拆析样本与数据的关系，终可能与重大发现“失之交臂”。
为了降低标签跳跃，illumina在可以使用udi双端特殊标签对样本进行标记，混样后进行测序。
udi的引入使得文库两端的index序列是不重复，一对一组合的，不存在共用。换句话说，只有两端带有*正确index序列的reads才能进入后续的样本分析，从而可以剔除标签错配的reads，有效避免样本之间的数据串扰。
一句话总结：采用udi策略，能更正确拆解测序数据与样本之间的一一对应关系，减小样本“戴错号码牌”的概率。
下面再来讲讲名为分子标签技术的umi：
umi的原理就是给每一条原始核酸片段加上一段*的标签序列，经pcr扩增后一起进行测序。这样根据不同的标签序列，生信人员就能区分不同来源的dna模板，分辨哪些是pcr扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。
一些需要较高正确度的应用，如肿瘤稀有突变分析，常会对5%、甚至1%左右的稀有变异作检测。这时一旦出现测序错误、或者pcr偏差，便会产生大量假阳性结果，因此需要添加umi进行校正。
一句话总结：做稀有突变检测、校正测序错误与pcr偏差，umi“劳苦功高”。
看到这里，关于udi和umi的介绍已基本完成。
接下来我们来看一个实际案例应用。
近我们收到一位宝粉的来信，咨询我们takara有没有什么好的文库构建方案↓
我们了解到这位宝粉的团队
① 近正在研发肿瘤稀有突变分析的项目；
② 样本类型主要是ffpe(石蜡包埋样本)、cfdna（游离dna）；
③ 起始量大概在几十ng；④准备自己建库，然后送样测序，平台是novaseq；
⑤ 由于是刚接触建库实验，不希望操作太复杂。
我思考了大概1秒钟，就从我们丰富的dna-seq文库构建产品线中找到了一款合适的产品↓
thruplex tag-seq hv
为什么说这款产品合适呢？我们来对标这位宝粉的几个需求。
需求1：希望操作简便，不要太繁琐
对标1：thruplex tag-seq hv这款试剂盒支持单管、三步操作，手动15 min，全程2 h，无需在建库过程中转管或纯化。
我们比较了thruplex hv和k、n两家公司的试剂盒，只有thruplex是单管操作、时间短、操作便捷的系统。
所以，无论新手还是老手，都能很快上手！
需求2：样本类型为ffpe dna、cfdna，起始量大概在几十ng
对标2：thruplex tag-seq hv支持5-200 ng ffpe dna、cfdna起始，input volume为30μl，无需样品浓缩。
需求3：novaseq测序分析稀有变异
对标3：thruplex tag-seq hv搭配udi建库，可以有效降低index hopping效应，是高通量型illumina测序仪的“友好伙伴”
thruplex tag-seq hv茎环形接头上还包含7位碱基的固定型umi，双端总共可有144种umi连接到dna分子两端，以识别一致序列，减少扩增或者测序错误带来的假阳性突变。
再举几个例子
takara科学家采用thruplex tag-seq hv对10 ng起始的quan-plex patient-like ctdna标准品（accuref）构建文库，肿瘤相关的基因采用idt xgen pan cancer panel进行捕获富集，随后用umis鉴定了ctdna标准品中特定位点的实际突变频率。结果显示，检测到的突变频率分别与预期1%、5%的等位突变频率接近，而阴性对照组没有在位点处检测到任何突变。
同时，为了比较umi与常规使用的坐标法之间的效果差异，takara科学家先使用未去重或者仅用坐标法去重的文件分析，在预期的egfr l858r突变附近观察到大量的低频及随机等位基因频率突变。而随后用umi校正、过滤数据后，清除了假阳性突变，得到了预期的突变分析结果！
经过几场对标，我们明确了thruplex tag-seq hv能满足那位宝粉开发cfdna/ffpe dna稀有突变项目的需求。
当然，若小伙伴们也有同等需求，thruplex tag-seq hv定能不负所望。
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umi的全称为unique molecular identifier，译为分子条形码或者分子标签技术。
别急，要弄清这两个概念，还得从二代测序的那些事情说起：
我们都知道二代测序技术是近十年来曝光率非常高、非常受关注的基因组分析技术。以illumina为代表的测序仪厂商不断推出更新型号的测序仪，不断刷新测序通量，但不变的仍是多样本混合后测序的策略。
要实现对多个样本同时测序，必须在各样本pcr扩增阶段，往核酸片段上添加一段分子序列作为样本标签，这种标签叫做index。
这样，每个样本就带上属于它的“专属号码牌”，在多样本混合测序后，生信工程师能通过“翻牌”，确定这个“号码”所代表的就是“寻寻觅觅”的那个“它”。
index一般由8位碱基所组成，常有单端与双端两种添加模式，为了增加同时上样的通量，大家一般在面临大量样本同时测序时，会选择双端index↓
目前常用的双端index策略是通过少数几种index序列排列组合，去实现更多样本的标签区分（如96种），但这种方式一直存在交叉污染的可能。
同时，为了进一步提升通量与扩增效率，降低测序成本，illumina为novaseq等高通量型测序仪引入了图案化流动槽（patterned flow cell technology，pfct）和排他性扩增（exclusion amplification，examp）成簇技术。这两个看似美好的技术却无意间放大了一种叫做标签跳跃（index hopping）的样本标签错配的现象，导致科研人员无法正确拆析样本与数据的关系，终可能与重大发现“失之交臂”。
为了降低标签跳跃，illumina在可以使用udi双端特殊标签对样本进行标记，混样后进行测序。
udi的引入使得文库两端的index序列是不重复，一对一组合的，不存在共用。换句话说，只有两端带有*正确index序列的reads才能进入后续的样本分析，从而可以剔除标签错配的reads，有效避免样本之间的数据串扰。
一句话总结：采用udi策略，能更正确拆解测序数据与样本之间的一一对应关系，减小样本“戴错号码牌”的概率。
下面再来讲讲名为分子标签技术的umi：
umi的原理就是给每一条原始核酸片段加上一段*的标签序列，经pcr扩增后一起进行测序。这样根据不同的标签序列，生信人员就能区分不同来源的dna模板，分辨哪些是pcr扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，哪些是患者真正携带的突变，从而提高检测灵敏度和特异性。
一些需要较高正确度的应用，如肿瘤稀有突变分析，常会对5%、甚至1%左右的稀有变异作检测。这时一旦出现测序错误、或者pcr偏差，便会产生大量假阳性结果，因此需要添加umi进行校正。
一句话总结：做稀有突变检测、校正测序错误与pcr偏差，umi“劳苦功高”。
看到这里，关于udi和umi的介绍已基本完成。
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① 近正在研发肿瘤稀有突变分析的项目；
② 样本类型主要是ffpe(石蜡包埋样本)、cfdna（游离dna）；
③ 起始量大概在几十ng；④准备自己建库，然后送样测序，平台是novaseq；
⑤ 由于是刚接触建库实验，不希望操作太复杂。
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对标1：thruplex tag-seq hv这款试剂盒支持单管、三步操作，手动15 min，全程2 h，无需在建库过程中转管或纯化。
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所以，无论新手还是老手，都能很快上手！
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需求3：novaseq测序分析稀有变异
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同时，为了比较umi与常规使用的坐标法之间的效果差异，takara科学家先使用未去重或者仅用坐标法去重的文件分析，在预期的egfr l858r突变附近观察到大量的低频及随机等位基因频率突变。而随后用umi校正、过滤数据后，清除了假阳性突变，得到了预期的突变分析结果！
经过几场对标，我们明确了thruplex tag-seq hv能满足那位宝粉开发cfdna/ffpe dna稀有突变项目的需求。
当然，若小伙伴们也有同等需求，thruplex tag-seq hv定能不负所望。
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