层浪流式笔记-间充质干细胞标志物检测
近些年，以干细胞治疗为基础的再生医学逐渐发展起来。间充质干细胞（mesenchymal stem cell, msc）作为干细胞的一种，正受到科学家的关注。
间充质干细胞（msc）是一类存在于多种组织（如骨髓、脐带、胎盘、脂肪等），具有自我更新能力和多向分化潜力的成体干细胞。具有易获取、低免疫原性、低致瘤性、良好增殖率等多个特点，因在免疫调节和组织再生上的巨大潜力而受到更多的关注。
duc m hoang教授2022年发表了一篇综述[1]，对间充质干细胞（msc）在各系统疾病治疗领域的临床研究成果进行了系统性的总结，包括神经系统疾病、肺功能障碍、代谢/内分泌相关疾病、生殖障碍、皮肤烧伤和心血管疾病等。文中提到，在临床试验中，msc治疗是安全的，不过仍需要进行大规模的临床试验。msc来源特异性的疾病治疗也是研究者关注的一个方向。
截止2023年8月底，我国已有近70种msc药物获得药物临床试验申请（ind）受理（数据来源于国家药品评审中心），涉及较多的适应症，包括膝骨关节炎、间质性肺病、移植物抗宿主病及急性呼吸窘迫综合征。
图1：msc来源及分化（来源：doi:10.1080/17474124.2018.1393332）
在间充质干细胞的研究中，细胞的鉴定是很重要的一个环节。
自1991年msc的概念提出后，科学家们使用不同的分离培养方法，用不同的标志物来研究msc，没有形成统一的鉴定标准，增加了msc研究的难度。因此，国际细胞治疗协会（isct）在2006年定义了msc的低标准[2]，是目前被广泛接受的一种鉴定方法，如table1所示：
接下来小编为您展示下层浪longcyte™流式细胞仪检测msc表面标志物的数据。
实验方案：
图2：msc表面标志物配色方案
染色步骤：
part.1 取传代培养的人脐带间充质干细胞（h ucmscs），胰酶消化收集细胞，加入pbs调整细胞浓度为10 x106cells/ ml；
part.2 取7个流式管，每管分别加100ul细胞悬液，空白管不加抗体，其余的管按照抗体使用说明书分别加入相应荧光抗体cd90-fitc、cd105-pe、cd73-apc、cd45-pe-cy7、cd34-apc-cy7、hla-dr-af700，混匀，室温避光孵育30 min；
part.3 加2mlpbs，1500r，离心5 min，弃上清液，加入300ulpbs重悬细胞；
part.4 上流式细胞仪，检测细胞表面标志物的表达。
数据展示：
图3：msc表面标志物检测（a：主细胞群；b-g：分别是阳性指标cd73、cd105、cd90和阴性指标hla-dr、cd34、cd45的百分比）
圈门逻辑：
01通过fsc-h/ssc-h设门，排除碎片，圈出主细胞;
02建立直方图，横坐标分别选择cd73、cd105、cd90、hla-dr、cd34、cd45；
03在仪器软件上选择图层编辑功能，与空白管对应指标的直方图进行叠加，得到每个指标的百分比。
总结:
1.层浪longcyte™流式细胞仪软件操作简单，可直接获得峰形叠加图，进行归一化和平滑处理，对流式图进行美化处理；
2.有批量操作功能，可批量自动上样，批量分析数据，批量导出流式图，节约整体实验时间。
层浪临床型longcyte™3光14色流式细胞仪可满足多种荧光染料同时使用，欢迎大家使用层浪流式细胞仪，共同探索更多的多色流式检测方案。
图4：层浪生物longcyte™3光14色流式细胞仪
参考文献：
（1）duc m. hoang ,phuong t. pham,etal.stem cell-based therapy for human diseases.
signal transduct target ther.2022 aug 6;7(1):272.
（2）dominici, m，le blanc, k,etal.minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. the international society for cellular therapy position statement.
（3）f gao1,s m chiu,etal.mesenchymal stem cells and immunomodulation: current status and future prospects.cell death dis,2016 jan 21;7(1):e2062.
（4）hajir ibraheim1,chiara giacomini,etal.advances in mesenchymal stromal cell therapy in the management of crohn's disease.expert rev gastroenterol hepatol,2018 feb;12(2):141-153.
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duc m hoang教授2022年发表了一篇综述[1]，对间充质干细胞（msc）在各系统疾病治疗领域的临床研究成果进行了系统性的总结，包括神经系统疾病、肺功能障碍、代谢/内分泌相关疾病、生殖障碍、皮肤烧伤和心血管疾病等。文中提到，在临床试验中，msc治疗是安全的，不过仍需要进行大规模的临床试验。msc来源特异性的疾病治疗也是研究者关注的一个方向。
截止2023年8月底，我国已有近70种msc药物获得药物临床试验申请（ind）受理（数据来源于国家药品评审中心），涉及较多的适应症，包括膝骨关节炎、间质性肺病、移植物抗宿主病及急性呼吸窘迫综合征。
图1：msc来源及分化（来源：doi:10.1080/17474124.2018.1393332）
在间充质干细胞的研究中，细胞的鉴定是很重要的一个环节。
自1991年msc的概念提出后，科学家们使用不同的分离培养方法，用不同的标志物来研究msc，没有形成统一的鉴定标准，增加了msc研究的难度。因此，国际细胞治疗协会（isct）在2006年定义了msc的低标准[2]，是目前被广泛接受的一种鉴定方法，如table1所示：
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实验方案：
图2：msc表面标志物配色方案
染色步骤：
part.1 取传代培养的人脐带间充质干细胞（h ucmscs），胰酶消化收集细胞，加入pbs调整细胞浓度为10 x106cells/ ml；
part.2 取7个流式管，每管分别加100ul细胞悬液，空白管不加抗体，其余的管按照抗体使用说明书分别加入相应荧光抗体cd90-fitc、cd105-pe、cd73-apc、cd45-pe-cy7、cd34-apc-cy7、hla-dr-af700，混匀，室温避光孵育30 min；
part.3 加2mlpbs，1500r，离心5 min，弃上清液，加入300ulpbs重悬细胞；
part.4 上流式细胞仪，检测细胞表面标志物的表达。
数据展示：
图3：msc表面标志物检测（a：主细胞群；b-g：分别是阳性指标cd73、cd105、cd90和阴性指标hla-dr、cd34、cd45的百分比）
圈门逻辑：
01通过fsc-h/ssc-h设门，排除碎片，圈出主细胞;
02建立直方图，横坐标分别选择cd73、cd105、cd90、hla-dr、cd34、cd45；
03在仪器软件上选择图层编辑功能，与空白管对应指标的直方图进行叠加，得到每个指标的百分比。
总结:
1.层浪longcyte™流式细胞仪软件操作简单，可直接获得峰形叠加图，进行归一化和平滑处理，对流式图进行美化处理；
2.有批量操作功能，可批量自动上样，批量分析数据，批量导出流式图，节约整体实验时间。
层浪临床型longcyte™3光14色流式细胞仪可满足多种荧光染料同时使用，欢迎大家使用层浪流式细胞仪，共同探索更多的多色流式检测方案。
图4：层浪生物longcyte™3光14色流式细胞仪
参考文献：
（1）duc m. hoang ,phuong t. pham,etal.stem cell-based therapy for human diseases.
signal transduct target ther.2022 aug 6;7(1):272.
（2）dominici, m，le blanc, k,etal.minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. the international society for cellular therapy position statement.
（3）f gao1,s m chiu,etal.mesenchymal stem cells and immunomodulation: current status and future prospects.cell death dis,2016 jan 21;7(1):e2062.
（4）hajir ibraheim1,chiara giacomini,etal.advances in mesenchymal stromal cell therapy in the management of crohn's disease.expert rev gastroenterol hepatol,2018 feb;12(2):141-153.
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