核酸探针标记的实验过程
实验原理
分子生物研究中，常用的探针即为双链dna探针，它广泛应用于转基因植物拷贝数的鉴定、临床诊断等方面。双链dna探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。
切口平移法(nick translation) 当双链dna分子的条链上产生切口时,e.coli dna聚合酶ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着dna链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。合适的切口平移片段般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32p]dntp的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) dna酶的用量和e.coli dna聚合酶ⅰ的质量会影响产物片段的大小。(c) dna模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的dna。
实验试剂
(1) 10×切口平移缓冲液: 0.5m/l tris-cl (ph7.2)； 0.1m/l mgso4； 10mm/l dtt； 100ug/ml bsa。
(2) 未标记的dntp原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mm/l tris·cl (ph7.5)溶液中,浓度为0.3mm/l。
(3) [α-32p] dctp或[α-32p]datp:400 ci/mm, 10uci/ul。
(4)e.coli dna聚合酶ⅰ：(4单位/ul)：溶于50ug/ml bsa, 1mm/l dtt, 50%甘油，50mm/l tris·cl(ph7.5)中。
(5) dna酶:1mg/ml。
(6) edta :200mm/l (ph8.0)。
(7) 10m/l nh4ac。
实验步骤
(1) 按下列配比混合:
未标记的dntp 10ul
10×切口平移缓冲液 5ul
待标记的dna 1ug
[α-32 p]dctp或datp(70uci) 7ul
e.coli dna聚合酶 4单位
dan酶 i 1ul
加水至终体积 50ul
(2) 置于15℃水浴60分钟。
(3) 加入5ul edta终止反应。
(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5m/l, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收dna探针。
注意事项
1、3h，32p及35s标记的dntp都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 p]-dntp。
2、dna酶ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，dna酶ⅰ活性，则所得探针比活性，但长度比较短。
上海嘉鹏科技有限公司专业生产：紫外分析仪、三用紫外分析仪、暗箱式紫外分析仪、暗箱三用紫外分析仪、暗箱紫外分析仪、手提式紫外分析仪、三用紫外分析仪暗箱式、紫外检测仪、部分收集器、恒流泵、蠕动泵、凝胶成像系统、凝胶成像分析系统、化学发光成像分析系统、光化学反应仪、旋涡混合器、漩涡混合器、玻璃层析柱、梯度混合器、梯度混合仪、核酸蛋白检测仪、玻璃层析柱、荧光增白剂测定仪、馏分收集器、切胶仪、蓝光切胶仪、层析系统等产。
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(1) 10×切口平移缓冲液: 0.5m/l tris-cl (ph7.2)； 0.1m/l mgso4； 10mm/l dtt； 100ug/ml bsa。
(2) 未标记的dntp原液：除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mm/l tris·cl (ph7.5)溶液中,浓度为0.3mm/l。
(3) [α-32p] dctp或[α-32p]datp:400 ci/mm, 10uci/ul。
(4)e.coli dna聚合酶ⅰ：(4单位/ul)：溶于50ug/ml bsa, 1mm/l dtt, 50%甘油，50mm/l tris·cl(ph7.5)中。
(5) dna酶:1mg/ml。
(6) edta :200mm/l (ph8.0)。
(7) 10m/l nh4ac。
实验步骤
(1) 按下列配比混合:
未标记的dntp 10ul
10×切口平移缓冲液 5ul
待标记的dna 1ug
[α-32 p]dctp或datp(70uci) 7ul
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dan酶 i 1ul
加水至终体积 50ul
(2) 置于15℃水浴60分钟。
(3) 加入5ul edta终止反应。
(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5m/l, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收dna探针。
注意事项
1、3h，32p及35s标记的dntp都可使用于探针标记，但通常使用[α-32 p]-dntp。
2、dna酶ⅰ的活性不同，所得到的探针比活性也不同，dna酶ⅰ活性，则所得探针比活性，但长度比较短。
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